2018, Vol. 35文章信息
- 王青龙, 姜希娟, 范英昌, 庞晓丽
- WANG Qinglong, JIANG Xijuan, FAN Yingchang, PANG Xiaoli
- 雷帕霉素对动脉粥样硬化小鼠斑块面积影响及机制探讨
- Researching the mechanism of rapamycin on area of plaque in atherosclerotic mice
- 天津中医药, 2018, 35(8): 613-615
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2018, 35(8): 613-615
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2018.08.16
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文章历史
- 收稿日期: 2018-05-23
2. 天津中医药大学中西医结合学院, 天津 300193;
3. 天津中医药大学护理学院, 天津 300193
动脉粥样硬化（AS）是冠心病、脑梗死、外周血管疾病的主要原因。研究显示炎症反应可以促进粥样斑块进行性发展，继而破裂出血引发急性心脑血管事件[1]。因此，控制炎症反应可抑制斑块的发生发展。近年来，很多学者认为AS属于慢性免疫-炎症反应[2-3]，从免疫角度探讨AS发生发展中的炎症反应机制成为目前研究的热点之一。雷帕霉素作为一种免疫抑制剂，在抗AS方面的研究已经取得了一些进展[4-5]。然而，其具体作用机制尚未完全阐明。故实验通过建立小鼠动脉粥样硬化模型，探讨雷帕霉素对粥样斑块面积的影响及机制，以期为临床研究提供借鉴。
1 材料与方法 1.1 药物准备根据说明书，基于体表面积换算人鼠等剂量，并将药物溶入适量生理盐水中。
1.2 实验动物与分组选取健康ApoE基因敲除（ApoE-/-）雄性小鼠30只，体质量25~30 g，6~8周龄（国家卫生研究院提供）。动物适应性喂养2周后，采用随机数字表法将小鼠分为3组：模型组10只、雷帕霉素组（RAPA）10只，阳性药物（瑞伐他汀）组10只，另饲养C57小鼠10只作为空白对照组。空白对照组给予正常饮食，其他3组均给予高脂饮食12周。12周后，RAPA组和阳性药物组给予相应剂量药物灌胃4周，模型组与空白对照组给予等剂量生理盐水灌胃4周。4周后处死取材。
1.3 观察方法与指标1）处死小鼠后取主动脉窦斑块，冰冻连续切片后油红O染色，观察各组斑块内脂质情况。2）取主动脉窦及主动脉弓斑块，石蜡连续切片后苏木精-伊红（HE）染色, 利用图像分析仪评估斑块面积。3）取小鼠外周血，离心后取上清，采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定外周血中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（INF-γ）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、转化因子β（TGF-β）含量。
1.4 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件包进行分析，计量数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法行配对t检验，以P＜0.05定为有统计学差异。
2 结果 2.1 油红O染色模型组、雷帕霉素组及阳性药物组均形成动脉粥样硬化斑块，其中模型组形成的粥样斑块具有较大脂核，见图 1。
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| 图 1 各组斑块主动脉窦油红O染色（×40） Fig. 1 Aortic sinus imaging of Oil red staining among groups (×40) |
基于HE染色利用图像分析仪计算各组斑块面积及占管腔的百分比。结果显示，与模型组比较，雷帕霉素组斑块面积及狭窄程度明显小于模型组，有统计学意义（P＜0.05）；瑞伐他汀组虽然斑块面积与模型组比较无统计学意义（P＞0.05），但在狭窄程度方面有统计学意义（P＜0.05），见表 1。雷帕霉素组与瑞伐他汀组比较，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。
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| 图 2 各组斑块主动脉弓HE染色（×40） Fig. 2 Aortic arch imaging of Hematoxylin and eosin among groups(×40) |
结果显示，模型组与空白对照组比较，促炎因子明显升高，而抗炎因子明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；雷帕霉素组与模型组比较能有效降低促炎因子含量，增加抗炎因子表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；瑞伐他汀组与模型组比较除IL-10外，差异均匀统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
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近年来很多学者认为AS属于慢性免疫-炎症性疾病，斑块内大量巨噬细胞、淋巴细胞（主要为CD4+T细胞）、炎症因子聚集引发免疫炎症反应，可导致斑块进行性发展[6-7]。研究显示，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路激活后可促进巨噬细胞增殖、迁移及CD4+T淋巴细胞向效应性T细胞分化，进而导致AS炎症反应放大[5, 8]。因此，调控mTOR通路可抑制免疫炎症反应，进而抑制AS斑块进展。
雷帕霉素为免疫抑制剂，可通过抑制mTOR通路达到控制免疫反应的作用[4]。本研究油红O及HE染色显示，雷帕霉素组斑块脂核明显小于模型组。基于HE染色图像分析结果证明，该药可有效减小动脉粥样硬化小鼠体内斑块面积，降低血管狭窄程度，与临床治疗AS阳性药物-他汀类效果相同。说明一方面，AS进展过程中确实存在免疫反应；另一方面，这种免疫反应与mTOR通路关系密切。
在免疫引发的炎症反应方面，研究表明mTOR通路激活后，一方面可促进巨噬细胞增殖，增殖的巨噬细胞会释放大量炎症因子如TNF-α、INF-γ、IL-6等，加剧AS炎症反应[6, 9]。另一方面，可促进CD4+T亚群细胞向效应性T细胞分化，降低调节性T细胞（Treg）数量，进而导致Treg细胞分泌的抗炎因子IL-10、TGF-β表达降低，炎症反应放大[10-11]。本研究结果显示，雷帕霉素可有效降低动脉粥样硬化小鼠外周血中TNF-α、INF-γ、IL-6含量，增加IL-10、TGF-β含量。因此，推测这可能与该药抑制巨噬细胞增殖、增加Treg细胞数量有关。综上所述，雷帕霉素可通过增加抗炎因子含量、降低促炎因子含量来调控炎症反应，进而抑制斑块发展，降低血管狭窄程度。
总之，雷帕霉素为抗真菌感染、抗移植免疫反应药物，在治疗AS方面的研究尚处于起步阶段。本研究从炎症角度探讨该药对AS的作用机制，但在免疫炎症具体作用靶点方面还需进一步研究。
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2. Combine Traditional Chinese and Western Medicine Institute of Tianjin University of Traditional Chinese Medixine, Tianjin 300193, China;
3. Nursing School, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China