肺癌在所有肿瘤中是最主要的致死因素，已成为全球共同面对和急需解决的公共卫生问题之一^[1]。肺癌病死率逐年增加，严重威胁人类健康并加重社会负担^[2]。目前，西医临床上多采用化疗的方法进行治疗^[3]，但化疗的同时，患者的正常细胞也会受到损伤，不良反应较大，因此肺癌患者进行化疗时，临床上多采用中药复方进行辅助治疗^[4]。

当归补血汤由黄芪和当归两味中药组成，出自李东垣的《内外伤辨惑论》，是补气生血的经典名方^[5-6]。方中黄芪补脾肺之气，固护肌表，为君药；当归养血和营，为臣药，两药配伍，共奏补气生血之功效^[7]。当归补血汤化学成分复杂，主要含有黄酮类、多糖类及挥发油类成分。现代药理学研究表明，当归补血汤具有改善血液系统疾病、调节免疫系统、促进血管生成、抗肿瘤等药理作用^[8-9]。亦有临床报道用当归补血汤及其加减方作为肺癌化疗时的辅助用药^[10-11]，但当归补血汤辅助治疗肺癌的具体机制仍然不清晰。

由于中药具有多成分、多靶点的特点，为研究中药治疗某种疾病的作用机制增添了难度，网络药理学的出现促进了中药作用机制的研究。网络药理学融合了系统生物学、多向药理学、网络分析学及计算生物学等多学科的技术和内容，通过构建“疾病-表型-基因-药物”的多层次结构网络，从系统水平上揭示药物与疾病之间的关系，其系统性、整体性的思想与中医中药辨证论治、协同作用理念不谋而合^[12-14]。因此，本研究采用网络药理学方法，对当归补血汤多成分、多靶点与肺癌的复杂网络关系进行分析，旨在揭示当归补血汤辅助治疗肺癌的作用机制，为其应用提供一定的理论依据。

1 方法 1.1 研究思路

利用网络药理学的方法研究当归补血汤辅助治疗肺癌的实验思路见图 1。

1.2 当归补血汤活性成分的收集和筛选

本实验利用中药系统药理学分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）^[15]，分别以“黄芪”“当归”为关键词进行搜索，检索当归补血汤中的所有化学成分。将筛选条件设置为OB≥30%，DL≥0.18^[16]，筛选出当归补血汤中的活性成分。

1.3 当归补血汤成分靶点的垂钓

利用中药成分靶点数据库（HIT，http://lifecenter.sgst.cn/hit/）查询成分已验证的靶点^[17]，通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查询化合物的SMILES^[18]号，然后将SMILES号导入Swiss Target Prediction Database（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测成分的靶点^[19]。通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）^[20]将所有成分的靶点校准为官方基因名称。

1.4 疾病靶点的查找

通过Therapeutic Targets Database（TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）^[21]，Drugbank database（https://www.drugbank.ca/）^[22]，及DisGeNET database（http://www.disgenet.org/web/ DisGeNET/menu/home）^[23]查找肺癌相关靶点，并通过Uniprot数据库统一基因名称。

1.5 成分靶点与疾病靶点共同靶点的获取

通过Venny 2.1.0（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ venny/）^[24]将成分靶点与疾病靶点取交集得到共同靶点，这些共同靶点认为是当归补血汤辅助治疗肺癌可能的关键靶点。

1.6 网络的构建和分析

通过Cytoscape 3.2.1构建成分-靶点等多层次网络图。网络中节点的拓扑学特征可以通过Cytoscape中的NetworkAnalyzer进行计算，包括自由度、介数中心性及平均最短路径长度等，其中度值是较为重要的评价指标^[25]。

1.7 基因富集分析

通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行通路富集分析，并通过Omicshare平台（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）对通路富集分析的结果进行可视化处理^[26]。

2 结果 2.1 当归补血汤中活性成分的收集

通过TCMSP数据库查找到当归补血汤212个成分，其中黄芪87个，当归125个，经过OB值和DL值筛选后，黄芪剩余19个成分，当归剩余2个成分。中药中某些成分本身具有良好的生物活性，但因其口服生物利用度较低或不具有良好的类药性等，在筛选时易被过滤掉，因此，本实验在查阅文献的基础上^[27-29]，黄芪中加入活性成分黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ及黄芪甲苷，共有23个成分纳入后续研究，当归中加入活性成分阿魏酸及藁本内酯，一共4个成分纳入研究，见表 1。

2.2 靶点的收集

通过HIT数据库查找成分已通过实验验证的靶点，利用基于结构相似性原理的Swiss Target Prediction Database来预测成分的靶点，黄芪中共得到398个靶点，当归中得到60个靶点，删除重复项后，剩余194个靶点，其中有26个靶点为黄芪和当归所共有。通过TTD、Drugbank及DisGeNET数据库查找肺癌相关靶点，其中TTD数据库中查找到88个疾病靶点，Drugbank数据库查找到135个，DisGeNET数据库查找到70个靶点，删除重复后剩余263个疾病相关靶点。通过Venny 2.1.0将成分靶点与疾病靶点取交集，得到45个共同靶点，这45个共同靶点视为当归补血汤辅助治疗肺癌可能的潜在靶点，见图 2及表 2。

2.3 活性成分-对应靶点网络构建与分析

通过Cytoscape构建当归补血汤中成分-对应靶点的网络图，如图 3所示，该网络中包含了221个节点，458条边，其中节点代表当归补血汤中成分或者成分对应的靶点，边表示成分和靶点之间具有相互作用，通过网络图可以看出，存在多个成分对应一个靶点或者一个成分对应多个靶点的现象，表明当归补血汤是通过多成分、多靶点协同起效的方式辅助治疗肺癌的。通过Cytoscape构建当归补血汤中活性成分对应45个共同靶点的网络图，见图 4，网络具有68个节点（45个为靶点节点，23个为成分节点），103条边，利用Cytoscape中的NetworkAnalyzer分析节点的度值及相关参数，节点颜色由粉色变红色表明度值逐渐增大，根据度值判断靶点的重要性，由图 4可以看出，成分度值排名前3的为山奈酚（AR-15，度值20）、槲皮素（AR-19，度值8）、芒柄花素（AR-12，度值7），这些成分可能是当归补血汤辅助治疗肺癌比较重要的成分，靶点度值排名前3的为微管相关蛋白Tau（MAPT，度值12）、细胞色素P450 19A1（CYP19A1，度值10）、雌激素受体α（ESR1，度值8），当归补血汤可能通过作用于这些靶点发挥辅助治疗肺癌的作用。

2.4 通路富集分析及当归补血汤活性成分-靶点-关键通路网络的构建

通过DAVID平台对45个靶点进行基因的功能注释及通路富集分析，结果表明45个靶点参与了170个生物过程相关的条目、30个细胞组成相关条目、54个分子功能相关条目，根据FDR < 0.05进行筛选，生物过程筛选出16个条目，主要涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、细胞增殖的正向调控等方面；细胞组成筛选出3个条目，涉及受体复合物、细胞器膜等方面；分子功能筛选出12个条目，主要涉及受体信号蛋白酪氨酸激酶活性、ATP结合等方面，见图 5。将DAVID通路富集分析结果P值< 0.01的前27条通路通过Omicshare平台进行可视化，结果见图 6，图中圆点越大，表明通路富集到的基因数目越多，圆点的颜色越红，表明P值越小。对FDR < 0.05的8条通路通过Cytoscape构建当归补血汤中中药-活性成分-靶点-关键通路网络，结果如图 7所示，其中度值较高的通路为癌症通路（pathwanys in cancer，度值15）、癌症蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer，度值11）、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路（PI3K-Akt signaling pathway，度值12）等，表明当归补血汤可能通过作用于这些通路来达到辅助治疗肺癌的目的。

3 讨论

当归补血汤由黄芪和当归两味药组成，是“补气生血”的经典方，可用于治疗多种疾病，临床上也用于肺癌化疗时的辅助用药^[10]。由于中药复方由多味中药组成，每味中药组成成分复杂，每个成分对应靶点较多，靶点之间可能存在协同或拮抗等作用，因此难以阐明中药复方治疗某种疾病的作用机制。网络药理学是在研究者所建立的数据库中进行中药成分、成分靶点、疾病靶点的查找，可以系统性、整体性的揭示靶点与疾病之间的相互关系，阐明中药复方治疗疾病的作用机制，这与中医整体观、辨证论治的思想不谋而合^[12]。因此，本研究采用网络药理学的方法，探究当归补血汤辅助治疗肺癌的作用机制，为临床上当归补血汤的使用提供一定的理论指导。

本研究分析了当归补血汤中黄芪和当归两味中药的活性成分，通过数据库的查找、筛选及文献的查阅，最终得到27个活性成分，其中23个属于君药黄芪，4个属于臣药当归。通过数据库的查询，黄芪中得到398个靶点，当归中得到60个靶点，删除重复靶点后，剩余194个成分靶点，有26个靶点为黄芪和当归所共有。通过公共数据库的查找，共查找到疾病相关靶点263个，将成分靶点与疾病靶点取交集后，得到45个共同靶点，这45个靶点视为当归补血汤辅助治疗肺癌可能的关键靶点。通过构建当归补血汤中活性成分-45个潜在作用靶点网络，预测出槲皮素、山奈酚、芒柄花素可能是当归补血汤辅助治疗肺癌的关键成分，已有研究表明槲皮素可以诱发BCL2/BAX介导的A549细胞凋亡坏死，并且通过扰动微管的有丝分裂，导致单极纺锤体的形成，造成细胞分裂的失败，槲皮素还可以通过抑制波形蛋白和n-钙黏蛋白的表达抑制A549细胞的迁移^[30]；山奈酚可以抑制人非小细胞肺癌A549细胞的活力，降低cyclinD1的表达水平，用山奈酚处理A549细胞后，p-PI3K和p-Akt水平降低，表明山奈酚可以通过抑制PI3K-Akt信号通路的激活发挥抗肿瘤的作用^[31]；芒柄花素可以改变细胞周期相关蛋白p21、细胞周期蛋白A及细胞周期蛋白D1的表达水平，诱导A549及NCI-H23两种非小细胞肺癌细胞株细胞周期阻滞于G1期，从而促进细胞凋亡^[32]。槲皮素、山奈酚、芒柄花素均可在一定程度上抑制肺癌的发展，表明网络药理学的结果具有一定的可靠性。黄芪多糖是黄芪的有效部位，现代大量研究表明黄芪多糖具有良好的调节免疫、抗肿瘤的作用，因此可以用作治疗肺癌时的辅助用药^[33]，如王永清^[34]等发现黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长具有抑制作用，增强机体的免疫功能、抑制血管内皮生长因子（VEGF）的表达及增加内皮抑素（Endostatin）的表达是其可能的作用机制，但黄芪多糖本身是一种混合物，结构较为复杂，而网络药理学主要关注小分子化合物，因此在本研究中未涉及黄芪多糖。MAPT、CYP19A1、ESR1等是当归补血汤辅助治疗肺癌的主要靶点。MAPT与微管的聚合及解聚密切相关，并可以维持微管动力学的平衡^[35]。MAPT与紫杉类药物具有相同的结构域，因此，当MAPT高表达时，可以竞争性的与微管结合，这可能是采用紫杉类药物对肺癌患者进行化疗时机体产生耐药性的原因^[36]，亦有研究通过miR-186靶向MAPT调节非小细胞肺癌对紫杉醇的化疗敏感性^[37]。CYP19A1又称为芳香化酶或雌激素合成酶，可以将人体内雄激素转化为雌激素，是该过程的关键限速酶^[38]，雌激素可以促进肺癌细胞的增殖，肺癌患者中雌激素水平往往高于正常人体，抗雌激素药物对肺癌的发展具有抑制作用^[39]，有研究表明，非小细胞肺癌患者标本中的CYP19A1蛋白含量明显高于正常标本^[40]，亦有研究发现，CYP19A1基因的一个单核苷酸多态性基因分型rs3764221通过引起更高水平CYP19A1的表达而促进肺腺癌的发展^[41]。因此推测当归补血汤可以作用于CYP19A1，从而减少雌激素的合成，抑制肺癌细胞增殖，达到辅助治疗肺癌的作用。雌激素是类固醇激素，通过与靶器官上的雌激素受体结合而在体内发挥作用。雌激素受体主要有两个亚型，雌激素受体α（ESR-α，ESR1）和雌激素受体β（ESR-β，ESR2）^[42]。Unai等^[40]发现ESR1在正常肺组织样本中的表达要明显高于非小细胞肺癌样本，并且高表达ESR1的非小细胞肺癌患者生存率有所升高。现代研究表明，ESR1可以通过上调细胞周期蛋白D1的水平促进细胞异常增殖，并且抑制细胞凋亡从而促进肿瘤的生长，ESR1也可以与EGFR相互作用激活PI3K-Akt信号通路促进细胞的增殖，该信号通路可以调节ESR1的活性，同样ESR1对PI3K-Akt信号通路也具有调节作用^[43]。有研究表明，PI3K-Akt通路可以参与免疫抑制微环境的形成，影响肿瘤微环境内免疫细胞的活性，而阻断该通路可以恢复机体被破坏的免疫应答，增强自身免疫，从而增强抗肿瘤固有的免疫效应^[44]。肺癌患者在化疗的同时，不仅杀死了癌细胞，人体的正常细胞也会受到损伤，使人体的免疫功能下降，中医学中的“气血阴阳亏虚”与现代医学中人体免疫功能低下关系密切，而当归补血汤可以补气生血^[45]，因此推测当归补血汤可能作用于ESR1，从而抑制PI3K-Akt信号通路的激活，通过增强自身的免疫能力达到辅助治疗肺癌的目的，但该推测仍需要通过进一步的实验进行验证。细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）及细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）与肺癌的发展关系密切^[46]，当归补血汤可能通过作用于CDK4及CDK2抑制细胞周期进程，从而起到辅助治疗肺癌的作用。肺癌的侵袭和转移依赖于丰富的血液供应，血管内皮生长因子（VEGF）在肺癌患者中高表达，基质金属蛋白酶（MMP）水平在肺癌患者中亦有所升高，从而促进肿瘤转移^[47]，因此推测当归补血汤可能作用于VEGF及MMP抑制肺癌的侵袭和转移，达到辅助治疗肺癌的目的。以上研究均表明MAPT、CYP19A1、ESR1、CDK4、CDK2、VEGF、MMP等基因与肺癌的发生发展密切相关，表明网络药理学预测的结果具有一定的可靠性。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法，初步研究了当归补血汤中活性成分辅助治疗肺癌的作用机制，表明当归补血汤通过多成分、多靶点、多通路的方式达到协同起效的目的，为后续进一步研究当归补血汤辅助治疗肺癌的作用机制奠定了基础，为临床上当归补血汤的合理应用提供了理论依据。