2019, Vol. 36文章信息
- 汪作元, 李敏, 杨静, 柴欣, 王跃飞
- WANG Zuoyuan, LI Min, YANG Jing, CHAI Xin, WANG Yuefei
- 小茴香中反式茴香脑的含量测定及其变化规律研究
- Determination of the trans-anethole content in fructus foeniculi and its variation rule
- 天津中医药, 2019, 36(10): 1021-1024
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2019, 36(10): 1021-1024
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2019.10.20
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文章历史
- 收稿日期: 2019-05-29
小茴香为伞形科植物茴香（Foeniculum vulgare Mill.）的干燥成熟果实，又名怀香、怀香子、茴香子，具有温肾暖肝、散寒止痛、理气和胃之功效[1]。小茴香常被用作调味品和香料，小茴香主要含有挥发油、脂肪油、甾醇、糖苷、氨基酸等多种成分[2]，挥发油是小茴香的主要药效成分[3]，现已从小茴香挥发油中分离出40种化合物，具有抗炎镇痛、抑菌、抗氧化等作用[4-5]。研究表明挥发油中主要成分为反式茴香脑，占挥发油含量的80%左右[6]，分布在叶、花、果实中，以果实中挥发油及反式茴香脑含量最高。反式茴香脑作为升白宁注射液的主要成分，对预防和治疗白细胞减少症具有良好的效果[7]。
小茴香中反式茴香脑易挥发，文献报道多采用GC[8-10]、GC-MS联用仪[11]等方法进行测定。反式茴香脑具有共轭结构，紫外吸收较好；液相色谱仪普及性高且操作便利性好。本研究建立了超高效液相色谱法（UPLC）测定小茴香中反式茴香脑含量的方法，并分析了小茴香及其盐制品中反式茴香脑的含量差异；研究了室温条件下小茴香药材（生品）及其粉末中反式茴香脑随放置不同时间的含量变化规律。
1 仪器与材料 1.1 仪器Waters ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；DL-180E超声仪（50 kHz，180 W）；XS 205十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AL 204型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。
1.2 材料小茴香药材（生品）（S1~S7），产地为内蒙古；其中药材S1~S4购自河北春开制药股份有限公司；药材S5~S7购自天津中药饮片有限公司。盐小茴香饮片（Y1~Y4）是作者参照盐制法炮制工艺炮制；盐小茴香饮片（Y5~Y7），产地为内蒙古，购自天津中药饮片有限公司；反式茴香脑（批号：18041304）购自成都普菲德生物技术有限公司；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；甲酸（色谱纯，阿拉丁）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市康科德科技有限公司）。
2 方法与结果 2.1 小茴香药材（生品）及粉末稳定性研究取小茴香药材（生品）（S1）适量，等量分装于9个密封袋中，分别于1、2、3、4、5、10、20、31、44 d取样。
取小茴香药材（生品）（S1）适量，粉碎，粉末（过三号筛）等量分装于9个密封袋中，分别于1、2、3、4、5、10、20、31、44 d取样。
取小茴香药材（生品）（S1）适量，粉碎，粉末（过三号筛）置于同一密封袋中，分别于0、1、2、3、4、6、8、10、12 h取样。
2.2 盐小茴香饮片的炮制小茴香药材（生品）200 g，精密称定，置于炒药锅内，将小茴香翻炒均匀，炒至微显火色，喷淋25%盐水溶液（每100 kg小茴香用食盐2 kg），继续炒至微干，炒制15 min（功率1 300 W），取出，放凉。
2.3 对照品溶液的配制取反式茴香脑对照品适量，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇配制成0.94 mg/mL的储备液，取适量储备液配制成18.8 μg/mL的对照品溶液。
2.4 供试品溶液的制备取小茴香，粉碎，取粉末（过三号筛）0.5 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入适量无水乙醇，密塞，室温下超声处理（功率144 W，频率40 kHz）10 min，放冷至室温，定容至刻度，摇匀，4 ℃下14 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，即得。
2.5 色谱条件色谱柱：Acquity UPLC®誖BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇-0.1%甲酸水（55：45），流速0.3 mL/min；检测波长254 nm；进样量2 μL；柱温40 ℃；样品箱温度5 ℃。
2.6 方法学考察 2.6.1 线性关系考察取适量反式茴香脑储备液配制成浓度为2.35 ~ 150.40 μg/mL的系列对照品溶液，按“2.5”项下色谱条件测定，平行进样2次，以对照品浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程，反式茴香脑线性回归方程为Ŷ=61 069X-12 840，相关系数r=0.999 9，表明反式茴香脑在2.35 ~ 150.40 μg/mL范围内线性关系良好。
2.6.2 精密度实验精密称取小茴香药材（生品）粉末（现粉），按“2.4”项下方法每天制备1份小茴香供试品溶液，按“2.5”项下色谱条件重复进样6次，连续测定3 d，记录峰面积，计算其RSD值，日内精密度RSD值为0.40%，日间精密度RSD值为1.11%，结果表明仪器精密度良好。
2.6.3 重复性实验精密称取小茴香药材（生品）粉末（现粉）6份，按“2.4”项下方法制备小茴香供试品溶液6份，按“2.5”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算反式茴香脑平均含量为10.17 mg/g；RSD值为0.50%，表明该方法重现性良好。
2.6.4 稳定性实验精密称取小茴香药材（生品）粉末（现粉），按“2.4”项下方法制备小茴香供试品溶液，按“2.5”项下色谱条件分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h进样测定，记录峰面积，计算反式茴香脑的稳定性RSD值为0.33%，表明供试品溶液室温放置5 h稳定性良好。
2.6.5 加样回收率实验精密称取已知含量的小茴香药材（生品）粉末（现粉）0.25 g，准确加入与样品中反式茴香脑质量相当的对照品溶液，按“2.4”项下方法制备小茴香供试品溶液，平行6份，按“2.5”项下色谱条件进样测定2次，反式茴香脑的平均加样回收率为102%，RSD=2.23%（n=6）。结果见表 1，表明反式茴香脑加样回收率良好，方法准确可行。
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采用已建立的UPLC分析方法测定不同批次小茴香药材（生品）、盐小茴香饮片。精密称取不同批次的小茴香粉末（现粉），按“2.4”项下方法制备小茴香供试品溶液2份，按“2.5”项下色谱条件每份供试品溶液进样测定2次，计算不同批次小茴香粉末中反式茴香脑的含量，小茴香中反式茴香脑UPLC色谱图见图 1，结果见表 2。7批小茴香药材（生品）中反式茴香脑的含量为9.19~15.05 mg/g，2015年版《中华人民共和国药典》规定小茴香药材含反式茴香脑不得少于1.4%，小茴香药材（生品）（S1、S5~S7）不符合中国药典的规定，合格率低于50%；7批盐小茴香饮片中反式茴香脑的含量为9.09~16.02 mg/g，2015年版《中华人民共和国药典》规定盐小茴香饮片含反式茴香脑不得少于1.3%，盐小茴香饮片（Y1、Y5~Y7）不符合中国药典的规定，合格率低于50%。通过分析4批样品炮制前后反式茴香脑的含量变化，盐制后小茴香中反式茴香脑略有变化。
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| 图 1 小茴香中反式茴香脑的UPLC色谱图（A、对照品溶液B、供试品溶液） Fig. 1 UPLC chromatogram of trans-anethole in Fructus Foeniculi (A. standard solution B. sample solution) |
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反式茴香脑具有较强挥发性，其含量随小茴香放置时间延长不断下降[12-13]，本研究系统考察了小茴香药材（生品）及其粉末在室温下放置不同时间反式茴香脑的含量变化规律。
分别于0、1、2、3、4、6、8、10、12 h取小茴香药材（生品）粉末适量，采用UPLC分别测定0 h样品中反式茴香脑含量a0，n小时（n=1、2、3、4、6、8、10、12）样品中反式茴香脑含量an。通过含量测定结果分析表明：小茴香药材（生品）粉碎后12 h内反式茴香脑随放置时间延长含量不断下降，在12 h时，其含量下降了23.23%，实验结果见图 2-A。分别于第1、2、3、4、5、10、20、31、44天从不同密封袋取小茴香药材（生品）粉末适量，现取现测，采用UPLC分别测定了1 d样品中反式茴香脑含量A1，n天（n=2、3、4、5、10、20、31、44）样品中反式茴香脑含量An。通过含量测定结果分析表明：小茴香药材（生品）粉碎后在室温条件下放置44 d内反式茴香脑随放置时间延长含量不断下降，在44 d时，其含量下降了72.48%，实验结果见图 2-B。
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| 图 2 小茴香药材（生品）粉碎后在室温条件下放置12 h反式茴香脑的含量变化情况（A）、放置44 d反式茴香脑的含量变化情况（B） Fig. 2 The variation of trans-anethole content in Fructus Foeniculi(raw)storaged at room temperature for 12 h(A) and for 44 d(B) after pulverization |
分别于第1、2、3、4、5、10、20、31、44天取小茴香药材（生品）适量，粉碎，现粉现用，采用UPLC分别测定1 d样品中反式茴香脑含量A1，n天（n=2、3、4、5、10、20、31、44）样品中反式茴香脑含量An。通过含量测定结果分析表明：小茴香药材（生品）在室温条件下放置44 d内反式茴香脑的含量基本稳定，其含量无明显变化，RSD值为2.90%，实验结果见图 3。
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| 图 3 小茴香药材（生品）室温下放置44 d现粉现测反式茴香脑的含量变化情况 Fig. 3 The variation of trans-anethole content in raw Fructus Foeniculi storaged at room temperature for 44 days(immediate detection after pulverization) |
通过系统研究小茴香药材（生品）及其粉末在室温下放置不同时间反式茴香脑的含量变化规律，揭示了小茴香药材（生品）粉末中反式茴香脑含量随放置时间延长不断下降，而小茴香药材（生品）中反式茴香脑含量基本稳定。因此，开展小茴香中反式茴香脑的含量测定时，小茴香必须现粉现测。
3 讨论本实验利用UPLC建立了小茴香中反式茴香脑的含量测定方法，本方法样品前处理简便，分析速度快，紫外吸收好，无其他成分干扰。
本实验从提取溶剂（甲醇、乙醇）、溶剂比例（25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、无水乙醇）、提取温度[（0±5）、（20±5）、（40±5）、（60±5）℃]、提取时间（5、10、15、20 min）、料液比（1:25、1:50、1:100）系统考察影响小茴香中反式茴香脑提取效率的因素，发现提取溶剂为无水乙醇、料液比为1:50、（20±5）℃超声10 min提取效率最高。
通过本实验研究，发现小茴香药材（生品）粉碎后反式茴香脑含量随放置时间延长不断下降，小茴香药材（生品）中反式茴香脑含量在规定放置时间内基本稳定。反式茴香脑为小茴香的指标成分，建议在进行小茴香中反式茴香脑含量测定时，小茴香必须现粉现测，即小茴香粉碎后，其粉末需在半小时内进行处理，保证测定结果的准确可靠。
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