芹菜籽为伞形科植物旱芹（Apium graveolens L.）的干燥成熟果实^[1]。芹菜籽在维吾尔医药中广泛应用，具有消除寒湿闭阴，消食健胃，消肿散气，消石止痛，调和百药等功效^[2]，是新疆资源丰富的药食兼用植物资源。芹菜籽中的挥发油是芹菜籽中的重要成分，具有抗氧化^[3]、降低亚硝酸钠活性^[4-5]、降低血液黏度^[6]、抗脑缺血^[7]、降血压^[8]等药理作用。同时其具有清新的香气，可用于食品、化妆品等行业^[9-10]。芹菜籽挥发油中的主要药效成分为丁苯酞。丁苯酞可用于治疗帕金森症、阿尔兹海默病、血管性痴呆、抑郁症、惊厥、癫痫等中枢神经系统疾病，同时可以用于心血管系统疾病，对某些糖尿病及高血压并发症具有一定的疗效^[11-16]。目前上市的国家一类新药丁苯酞软胶囊，临床上主要用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中。

在制剂过程中，挥发油处理的常规方式为直接喷洒，但是挥发油性质不稳定，对光、热、空气敏感，在制剂中易损失，为提高芹菜籽挥发油的稳定性和水溶性，减小刺激性，本研究采用羟丙基-β-环糊精包合芹菜籽挥发油，并采用星点设计效应面法对包合工艺进行优化。

1 仪器与材料 1.1 仪器

SSI型高效液相色谱仪（美国实验仪器公司）；Jade DSC型差示扫描量热仪（美国Perkin Elmer公司）；UV2450型紫外分光光度计（日本岛津）；BT25S型十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UPT-Ⅱ-10T型超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；SOP型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；85-2型数显恒温磁力搅拌器（江苏中大仪器科技有限公司）；LGJ-10型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；ZDHW型调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；WZJ-681型振动式药物超微粉碎机（济南倍力粉技术工程有限公司）；Five Eosy PlusTM FE20型pH计（METTLER TOLEDO）；TG16-WS型台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 试药

芹菜籽挥发油（实验室自制）；羟丙基-β-环糊精（山东滨州智源生物科技有限公司）；中性蛋白酶（江苏锐阳生物科技有限公司，200 000 U/g）；中温α淀粉酶（江苏锐阳生物科技有限公司，10 000 U/g）；丁苯酞对照品（批号101035-201502，中国食品药品检定研究院，含量以99.6%计）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；乙腈（色谱纯，天津康科德科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；石油醚（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；去离子水（自制，优普系列超纯水器）。

2 方法与结果 2.1 芹菜籽挥发油的提取

取芹菜籽适量，超微粉碎机粉碎，过五号药典筛。然后取过筛后的芹菜籽粉300 g，置于圆底烧瓶中，加入1 800 mL去离子水浸泡30 min。加磷酸调节pH至6.2，加入6 g复合酶（中性蛋白酶：中温α淀粉酶=1:1），混合均匀，置55 ℃水浴中酶解2 h，然后采用水蒸气蒸馏法提取5 h，即得淡黄色透明的芹菜籽挥发油，提取率为2.336%。

2.2 包合物制备方法

精密称取芹菜籽挥发油适量于烧杯中，加适量的无水乙醇溶解；另取各实验对应的羟丙基-β-环糊精于烧杯中，加2倍量的水溶解。将羟丙基-β-环糊精溶液置于磁力搅拌器上，固定转速，在各实验对应的恒定温度下逐滴加入挥发油乙醇溶液，搅拌至规定时间，包合液以2 000 r/min的转速离心2 min后，吸去上层未包合的挥发油，用0.45 μm孔径微孔滤膜过滤，放至冷冻干燥机，冷冻干燥24 h即得芹菜籽挥发油-羟丙基-β-环糊精包合物。

2.3 含量测定方法 2.3.1 色谱条件

高效液相色谱柱：Platisil C₁₈（Dikma公司，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相-乙腈：0.3%磷酸水（48:52），流速：1 mL/min，检测波长：235 nm；柱温：25 ℃，进样量20 μL，理论塔板数不低于2 500。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取丁苯酞对照品4.89 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到浓度为97.4 μg/mL的对照品贮备液。

2.3.3 供试品溶液的制备

精密称取0.5 g包合物样品置于25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm孔径微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3.4 线性关系考察

分别取“2.3.2”项下对照品溶液适量，甲醇稀释，摇匀，得到浓度为9.740、19.48、38.96、58.44、77.92、97.40 μg/mL的系列对照品溶液，用0.45 μm孔径微孔滤膜过滤，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定。以进样浓度（X）对峰面积（Y）做标准曲线，得丁苯酞的回归方程分别为：Ŷ=34 240X+11 521（r=0.999 8）。结果表明，丁苯酞在9.740~97.40 μg/mL的浓度范围内浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

2.3.5 精密度实验

精密吸取“2.3.2”项下对照品溶液，按上述色谱条件，进样20 μL，重复进样6次，测定丁苯酞的峰面积，按峰面积计算RSD值为0.70%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性实验

取同一批样品6份，按“2.3.3”项下方法制备包合物的供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定供试品溶液中丁苯酞的峰面积，计算RSD值为0.77%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.7 稳定性实验

取同一批包合物，按照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，按“2.3.1”项下色谱条件测定供试品中溶液中丁苯酞的峰面积，计算RSD值为1.5%，表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

2.3.8 加样回收率

精密称取已知含量的样品6份，精密加入一定量的对照品，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，根据峰面积计算平均回收率和RSD值。丁苯酞平均回收率为100.6%，RSD为1.7%（n=6），表明方法准确性良好。

2.4 评价指标

制备包合物的过程中的评价指标采用综合评分法，以包合率和包合物中丁苯酞的载药量为综合考察指标，按照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，采用高效液相色谱法测定包合物中丁苯酞的含量，以包合物中的丁苯酞总量与投入量的比值计算包合率Y₁，权重系数0.7；以包合物中丁苯酞的单位含量作为载药量Y₂，权重系数0.3。综合指标OD=（Y₁/Y_1max）×0.7+（Y₂/Y_2max）×0.3。

2.5 单因素考察 2.5.1 投料比单因素考察

精密称取芹菜籽挥发油5份，按照“2.2”项下包合物的制备方法，设定包合温度为40 ℃，包合时间为120 min，考察芹菜籽挥发油与羟丙基-β-环糊精的比例为1:50、1:25、3:50、2:25、1:10时的包合率和载药量，并计算OD值。实验结果见表 1，由结果可知投料比为2:25时，包合物的OD值最大，比例增大，挥发油的包合率会减小，包合物的OD值随之减小，因此选用投料比2:25为星点实验的中心点。

2.5.2 包合温度单因素考察

精密称取芹菜籽挥发油5份，按照“2.2”项下包合物的制备方法，设定挥发油与羟丙基-β-环糊精的比例为2:25，包合时间120 min，考察包合温度为30、40、50、60、70 ℃时的包合率和载药量，并计算OD值。实验结果见表 2，由结果可知包合温度为40 ℃时，包合物的OD值最大，温度升高或降低都不利于芹菜籽挥发油的包合，因此选用40 ℃为星点实验的中心点。

2.5.3 包合时间单因素考察

精密称取芹菜籽挥发油5份，按照“2.2”项下包合物的制备方法，设定挥发油与羟丙基-β-环糊精的比例为2:25，包合温度40 ℃，考察包合时间为40、80、120、160、200 min时的包合率和载药量，并计算OD值。实验结果见表 3，由结果可知，包合时间为160 min时，包合物的OD值最大，包合时间增长会导致挥发油损失，包合率下降，因此选用160 min为星点实验的中心点。

2.6 星点设计效应面法优化

效应面优化法就是通过拟合效应变量对考察因素变量的效应面，即函数f可以用某一数学模型近似地模拟函数，依据该模型可以描绘效应面，从效应面上选择最优的效应域，利用这一数学模型求得自变量的取值范围即最佳实验条件的优化法^[17]。

本实验通过单因素考察，确定了投料比、包合温度、包合时间的优化范围，采用三因素五水平的星点设计，以包合率和载药量的OD值为考察指标，对包合工艺进行优化，星点设计因素水平见表 4、星点设计实验安排与结果见表 5。

运用Design expert 10.0.3软件对实验数据进行回归分析，以OD值对自变量进行多元线性回归和二项式、三项式非线性拟合，多元线性方程为：OD=83.007 26-2.497 8A+0.102 51B+3.936 56×10-3C（P=0.218 8，失拟项P=0.001 2）；二项式拟合方程为：OD=26.813 53+630.33A+1.047 07B+0.180 93C-0.575AB-0.584 37AC+2.812 5×10-4BC-3 227.048 73A2-0.011 795 5B2-4.721 6×10^-4C²（P＜0.000 1，失拟项P=0.316 6）；三项式拟合方程为：OD=-10.130 10+ 1 112.114 63A+2.834 77B+0.202 59C-22.793 52AB-1.012 06AC+3.125×10^-5BC-3468.088 83A²-0.033 760B²-4.421 60×10^-4C²+3.125×10^-3ABC-1.541 04A²B+1.891 76A²C+0.274 56AB²（P=0.000 5，失拟项P=0.207 41）。二项式拟合模型P＜0.000 1，说明其具有统计学意义，该模型在本研究所选定的因素范围内有统计学意义；方程的失拟项不显著说明模型与实际情况模拟较好，没有失拟因素存在，可以选用此模型对实验结果进行分析，二项式回归模型方差分析见表 6。

2.7 验证实验

根据Design expert 10.0.3软件对实验结果的分析，得到两两因素对包合效果OD值影响的三维效应曲面图（见图 1）和等高线图（见图 2），软件预测最佳包合工艺条件为：挥发油与羟丙基-β-环糊精比例为2:25，包合温度44.5 ℃，包合时间167 min，在该包合条件下，综合评分（Y）的预测值为89.95，按上述优化结果的条件制备3批包合物，测定包合率和载药率，结果如表 7所示。所得平均OD值为89.95，实际值与星点设计预测结果基本一致，说明该拟合方程可较好地预测实验结果，该包合工艺稳定可行。

2.8 包合物的表征 2.8.1 紫外扫描法（UV）

取芹菜籽挥发油10 mg，加25 mL无水乙醇溶解，为样品a；取包合物0.15 g，加25 mL乙酸乙酯，超声20 min，0.45 μm孔径微孔滤膜滤过，续滤液为样品b；取包合物0.15 g，加25 mL乙酸乙酯，振摇后0.45 μm孔径微孔滤膜滤过，续滤液为样品c；取羟丙基-β-环糊精0.15 g，加25 mL无水乙醇溶解，为样品d。对4个样品进行紫外扫描，扫描范围200~400 nm。由图 3结果可知，羟丙基-β-环糊精对测定无干扰，芹菜籽挥发油的乙醇溶液与包合物的乙酸乙酯提取液在273 nm和280 nm处有明显的吸收峰，而包合物的乙酸乙酯溶液在这两个波长下没有吸收峰，说明芹菜籽挥发油被羟丙基-β-环糊精成功包合。

2.8.2 差示扫描量热法（DSC）

采用差示扫描量热法对芹菜籽挥发油包合物进行表征，测定气体为氮气，升温速度为10 ℃/min，升温范围为30~450 ℃，以空白坩埚为参比，分别测定芹菜籽挥发油、羟丙基-β-环糊精、芹菜籽挥发油包合物、羟丙基-β-环糊精与芹菜籽挥发油混合物。由图5可知，混合物的热曲线呈现两者特征叠加，说明两者只是物理混合。芹菜籽挥发油包合物与羟丙基-β-环糊精的热曲线相似，呈现羟丙基-β-环糊精的特征，未有挥发油热曲线的特征，表明羟丙基-β-环糊精成功包合芹菜籽挥发油。

3 讨论

目前，包合挥发油的材料主要有β-环糊精和羟丙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精是由β-环糊精和环氧丙烷缩合而成的一类羟烷基亲水性衍生物，与β-环糊精相比具有水溶性好、疏水性空腔大、安全性好等优点^[18]。本研究曾采用β-环糊精对芹菜籽挥发油进行包合，但是包合率低且重现性差，β-环糊精水溶性差，不利于药物溶出。因此本研究采用羟丙基-β-环糊精包合芹菜籽挥发油，以包合率和载药量的OD值作为评价指标，根据重要程度分配权重，优化出最优工艺。

星点设计-效应面优化法比正交实验更简便，比均匀设计法更全面，其实验次数较少，实验精度高，适用于多因素、多水平的实验^[19]。本实验通过单因素考察，确定出各因素的优化范围，采用星点设计-效应面法对芹菜籽挥发油包合工艺进行优化，通过二项式拟合方程预测实验结果。建立的HPLC方法适用于包合物中丁苯酞的含量测定，该方法操作简单，灵敏度高，专属性强，重现性好。

本实验通过星点设计-效应面法筛选出芹菜籽挥发油的最优包合工艺：采用饱和水溶液法，挥发油与羟丙基-β-环糊精比例为2:25，包合温度44.2 ℃，包合时间166 min，在此包合条件下，羟丙基-β-环糊精包合芹菜籽挥发油的包合率为78.95%，载药量为2.982 mg/g。采用UV、DSC对芹菜籽挥发油包合物进行表征，结果表明芹菜籽挥发油被羟丙基-β-环糊精成功包合。