糖尿病发生的一个必经阶段，称为“糖尿病前期”，包括糖耐量受损(IGT)和/或空腹血糖受损(IFG)^[1]。其中，IGT患者存在明显的胰岛素抵抗及分泌障碍，是糖尿病的危险人群^[2]。研究发现，糖尿病前期可增加肾脏、神经、视网膜及大血管病变的风险^[3-6]。因此，对IGT患者进行有效的干预可阻止糖尿病进展，对糖尿病防治将起到重大作用。肥甘厚腻饮食是引发IGT甚至2型糖尿病(T2DM)的重要原因之一^[7]，以阴虚热盛和湿热困脾为主^[8-9]。前期研究已证实^[10-11]，气虚和痰浊是T2DM主要的证候，气虚贯穿于糖尿病前期和T2DM病程的始终。T2DM以气阴两虚型和湿热困脾型为主，而糖尿病前期则以阴虚内热、湿热困脾为主。脾主运化、统血，输布水谷精微，喜燥恶湿，脾虚则气不足，堆积不能运化，淤积于体内助湿生痰。因此，按照益气补阴，补气益脾，清热除湿的治则可预防高脂高糖饮食引起的IGT向T2DM演变。本研究选取黄芪、茵陈蒿和荷叶三药配伍组成芪茵荷叶饮，并采用正交实验研究其能否预防IGT向T2DM演变，并从NF-κB信号通路入手，探明芪茵荷叶饮预防IGT向T2DM演变的作用机制。

1 材料 1.1 动物

4~5周龄清洁级SD雄性大鼠，体质量150~180 g，共110只。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 主要试剂与仪器

罗氏活力型血糖检测仪和血糖试纸，大鼠胰岛素ELISA试剂盒(上海宝曼生物科技有限公司)。HWY-100C恒温培养箱，Bio-Rad iMark酶标仪，EnSpire酶标仪。

1.3 药物制备

芪茵荷叶饮由黄芪、茵陈蒿和荷叶按比例配制，在天津中医药大学实验中心煎煮。每克中药加水6 mL浸泡30 min，武火煮沸后转文火煎煮30 min，过滤后收集煎液，原渣每克加水4 mL煎煮40 min，合并两次煎液，于60 ℃水浴浓缩成每毫升制剂相当于生药1 g，置4 ℃冰箱备用。给药前复温至25~30 ℃。

2 方法 2.1 造模方法^[12]

150~180 g清洁级雄性SD大鼠180只适应性喂养1周，随机抽取10只作为对照组(N)给予基础饲料喂养(碳水化合物65.42%，蛋白质占22.47%，脂肪占12.11%)，其余为IGT造模组，给予45%的高脂高糖饲料(碳水化合物占35%，蛋白质占20%，脂肪占45%)。所有饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。实验期间各组大鼠自由饮水，每日投食1次。喂养12周时，IGT造模组禁食12 h后，经鼠尾采血测空腹血糖(FBG)，以50%葡萄糖注射液2 g/kg体质量灌胃，2 h后再次鼠尾采血测OGTT 2 h血糖(2 h PG)，以3.9 mmol/L≤FBG＜6.1 mmol/L，7.8 mmol/L≤2 h PG＜11.1 mmol/L并持续1周以上为造模成功，成模率60%。

2.2 分组及给药方法

将100只建模成功的大鼠随机分为模型组1组和实验组9组(A，B，C，D，E，F，G，H，I)，设对照组1组，共11组，每组10只。按照《中国药典》给药剂量，进行大鼠与人体等效剂量换算后的剂量为中剂量，低剂量为中剂量一半，高剂量为中剂量的两倍。9组实验组用药剂量配伍按正交表L₉(3⁴)设计，见表 1。水煎混合悬液灌胃，模型组和对照组生理盐水灌胃，各组灌胃体积相同，每日1次，持续12周。灌胃期间各组大鼠均普通饲料喂养。

2.3 指标检测方法 2.3.1 血清指标检测

分别在给药前、给药6周和给药12周，大鼠禁食12 h后采用葡萄糖氧化酶法测FBG、采用酶联免疫分析法空腹胰岛素(FINS)水平。计算HOMA胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5。

2.3.2 骨骼肌取材

给药12周后取大鼠后肢骨骼肌样本，冻存于-80 ℃冰箱，待指标检测。

2.3.3 苏木精-伊红(HE)染色

将肌肉组织切片经苏木素浸染5 min左右，水洗l min，75%的盐酸乙醇分化30 s，水洗，氨水处理30 s，水洗1 min，酸化伊红乙醇液染12 min，流水快速冲洗、脱水、透明、封片固定。

2.3.4 实时荧光定量PCR检测方法

应用实时荧光反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测NF-κB信号通路节点基因相关mRNA含量。采用Trizol法提取骨骼肌总RNA，反转录为cDNA，反转录条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。荧光定量PCR仪进行基因表达量的检测，2^-ΔΔCt法对Real-time PCR结果进行定量分析。扩增条件为预变性95 ℃ 30 s，扩增反应为95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，反复40个循环。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，GAPDH作为内参照，GAPDH上游引物为:5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’；下游引物为:5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’；NF-κBp65上游引物为:5’-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3’，下游引物为:5’-CACTGTCACCTGGAAGCAGA-3’；IκB-α上游引物为:5’-TTGGTCAGGTGAAGGGAGAC-3’，下游引物为:5’-GCTTTCAGAAGTGCCTCAGC-3’。

2.4 统计学方法

采用SPSS 20.0进行统计学处理。符合正态分布的计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，正交实验采用直观分析和正交设计方差分析，重复测量资料采用重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 对大鼠空腹葡萄糖的影响

给药期各组大鼠空腹葡萄糖重复测量方差分析主效应结果显示:Mauchly球形检验P=0.326，满足“球对称”。不考虑时间因素，实验各组大鼠空腹葡萄糖有统计学意义(F_组间=4.269，P=0.000)。不考虑干预因素，各组大鼠空腹葡萄糖随时间变化而变化(F_时间=110.670，P=0.000)。时间与组别交互效应结果显示，实验各组大鼠空腹葡萄糖随时间的变化趋势差异有统计学意义(F_交互=3.240，P=0.000)。各组大鼠空腹葡萄糖变化情况:给药6周时除实验I组外其余各组血糖值均较给药前降低，其中实验E组下降最明显，与模型组相比具有统计学差异(P＜0.05)。给药12周时，各实验组FBG值均反弹，其中实验B组和E组均较模型组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 2。

3.2 芪茵荷叶饮对大鼠血清胰岛素的影响

给药期各组大鼠FINS重复测量方差分析主效应结果显示:Mauchly球形检验P=0.037，不满足“球对称”，采用校正法。不考虑时间因素，实验各组大鼠FINS有统计学意义(F_组间=13.922，P=0.000)。不考虑干预因素，各组大鼠FINS随时间变化而变化(F_时间=286.082，P=0.000)。时间与组别交互效应结果显示，实验各组大鼠FINS随时间的变化趋势差异有显著性(F_交互=5.118，P=0.000)，各组FINS随时间变化的趋势不一致。各组大鼠FINS变化:给药6周时各组FINS均较模型组降低，且有统计学差异(P＜0.05)。给药12周时各组FINS水平均较给药6周时升高，但各实验组(除A和B组)较模型组降低差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 3。

3.3 芪茵荷叶饮对大鼠HOMA-IR的影响

给药期各组大鼠HOMA-IR重复测量方差分析主效应结果显示:Mauchly球形检验P=0.335，满足“球对称”。不考虑时间因素，各组大鼠HOMA-IR有统计学意义(F_组间=8.784，P=0.000)。不考虑干预因素，各组大鼠HOMA-IR随时间变化而变化(F_时间=247.592，P=0.000)。时间与组别交互效应结果显示，实验各组大鼠HOMA-IR随时间的变化趋势差异有统计学意义(F_交互=2.631，P=0.001)，各组HOMA-IR随时间变化的趋势不一致。各组大鼠HOMA-IR变化情况:给药6周时除实验B组、C组及I组外，其余各组HOMA-IR均较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。给药12周，实验D组、F组、G组、H组和I组HOMA-IR均较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 4。

3.4 芪茵荷叶饮正交实验结果

给药12周时正交结果极差分析和方差分析显示，对FBG影响的主次因素为茵陈蒿＞黄芪＞荷叶，最佳配伍方案为中剂量黄芪+高剂量茵陈蒿+高剂量荷叶；对FINS影响的主次因素为黄芪＞荷叶＞茵陈蒿，最佳配伍方案为高剂量黄芪+高剂量茵陈蒿+中剂量荷叶；对HOMA-IR影响的主次因素为茵陈蒿＞黄芪＞荷叶，最佳配伍方案为低剂量黄芪+低剂量茵陈蒿+低剂量荷叶。方差结果分析显示，不同剂量的茵陈蒿对FBG影响存在统计学差异，不同剂量黄芪对FINS和HOMA-IR存在统计学差异。见表 5、表 6。

3.5 骨骼肌组织病理学变化

给药12周末，大鼠肌肉组织HE染色结果显示:对照组大鼠骨骼肌形态完整、肌纤维排列整齐；模型组及9组实验组大鼠骨骼肌肌纤维排列紊乱、均有水肿，模型组水肿较为明显、可见炎症细胞浸润，见图 1。

3.6 芪茵荷叶饮对大鼠骨骼肌IκB-α及NF-κBp65mRNA的影响

给药期间各实验组大鼠骨骼肌IκB-α表达经方差分析具有统计学差异(F=51.819，P＜0.01)，其中实验H组IκB-α明显高于模型组，差异有统计学意义。各组大鼠NF-κBp65mRNA方差分析结果显示具有统计学差异(F=51.819，P＜0.01)。与实验M组相比，A、C、G 3组NF-κBp65下降，其中G组差异有统计学意义(P＜0.05)，见表 7。

4 讨论

IGT是消渴症的前驱状态，中医称之为脾瘅。《圣济总录·消渴》中记有:“消瘅者，膏粱之疾也，肥美之过，积为脾瘅，瘅病既成。”饮食失节、劳逸失调，则脾运不健，水谷运化失司，痰湿凝聚，燥热内生。因此，按照补气益脾，清热除湿的治疗原则对高脂高糖饮食引起的IGT患者进行干预，可有效预防IGT向T2DM演变。据此自拟芪茵荷叶饮，本方中黄芪性味甘温、归肺、脾经，具有益气补虚功效，现代药理学研究也表明黄芪具有降血糖、降血脂之功效^[13]，是中医临床常用的降糖组方用药。茵陈蒿，性微寒味苦，归脾、胃、肝和胆经，具有清利湿热之效，研究表明茵陈蒿中的有效化合物β-谷甾醇、槲皮素等可通过多条信号通路作用于靶标蛋白发挥其抗炎、降脂作用^[14-15]。荷叶，性微温平味辛，归肝、脾经，清热除湿、利水通便，适用痰湿体质，荷叶具有降脂抗氧化之功效^[16]。

本研究通过高糖高脂饮食诱导的方法，成功构建了IGT大鼠模型，造模成功的大鼠出现了血糖升高、糖耐量受损等症状。给予芪茵荷叶饮干预6周后，除实验I组外其余各干预组FPG均有所下降，其中实验E组具有统计学差异(P＜0.05)；干预12周时FPG较干预6周时回升，除实验D组外均超过干预前水平，D组为唯一低于干预前水平组别，说明芪茵荷叶饮对IGT大鼠FPG具有调节作用，可能为高剂量茵陈蒿发挥主要作用，但调节血糖效果不稳定，仍需延长观察时间以确定疗效。FINS水平与胰岛β细胞功能、血糖的稳定以及T2DM发生发展密切相关，研究表明IGT的发生与FINS浓度的进一步增加有关^[17]。本研究干预6周时FINS下降，12周时略有回升但均未达到给药前水平，说明芪茵荷叶饮可通过调节FINS改善β胰岛细胞功能。HOMA-IR可以反映胰岛素抵抗状态和胰岛素敏感性，指数随胰岛素抵抗程度增加而升高。本研究中模型组大鼠HOMA-IR上升，出现IR状态，而经芪茵荷叶饮干预6周和12周后，部分实验组HOMA-IR较模型组下降，且除A和B组外均低于给药前水平，说明芪茵荷叶饮在保护胰岛β细胞、改善胰岛功能、减轻胰岛素抵抗方面具有一定功效。

正交实验结果提示，仅不同剂量茵陈蒿对FBG影响存在统计学差异，茵陈蒿取高剂量效果最佳；仅不同剂量黄芪对FINS和HOMA-IR存在统计学差异，黄芪取低剂量效果最佳。荷叶对3项指标的影响均不显著，从经济学角度可取低剂量。综合分析，黄芪为君、茵陈蒿为臣、荷叶为辅，低剂量黄芪、高剂量茵陈蒿配伍低剂量荷叶为最优方案。

本研究病理切片显示模型组大鼠骨骼肌组织水肿、有炎症细胞浸润，说明IGT大鼠骨骼肌存在炎性反应。研究表明，糖尿病前期就可能已经存在炎性反应^[18]。骨骼肌是机体慢性炎症发生、发展的重要组织，骨骼肌慢性炎症是T2DM发病的早期分子事件^[19]。胰岛素抵抗是IGT的主要表现，长期高脂饮食引起体重增加，可使体内炎性因子分泌增加、炎症信号通路激活，从而诱发胰岛素抵抗，导致骨骼肌稳态失调、肌组织结构受损^[20]。

NF-κB是重要转录激活因子，在静息状态下IκBα与NF-κB杂二聚体以结合形式位于细胞质中，抑制NF-κB活化。当机体受到某些外界刺激时，IκBα磷酸化从NF-κB二聚体解离，NF-κB活化并进入细胞核，调控细胞功能^[21]。相关研究表明NF-κB作为机体重要的炎症转录因子，与葡萄糖摄取紊乱及胰岛素抵抗密切相关，其表达水平在糖尿病前期即开始升高^[22]。本研究通过NF-κBp65和IκBα基因表达水平来反映NF-κB信号通路的激活状况。本研究中实验G组较M组NF-κBp65蛋白表达水平下降显著，G组为低剂量黄芪+高剂量茵陈蒿+低剂量荷叶，说明此配伍可能会抑制NF-κB信号通路进而减轻炎症反应，与正交实验结果一致。

5 结论

黄芪、茵陈蒿和荷叶三药存在交互作用，按影响主次顺序为黄芪>茵陈蒿>荷叶，最佳配伍为半量黄芪、2倍量茵陈蒿和半量荷叶。此配伍组方可改善IGT大鼠胰岛素抵抗，通过抑制NF-κB信号通路、减轻炎症反应，从而控制或延缓IGT向T2DM演变。