天津中医药  2019, Vol. 36 Issue (12): 1218-1221 |
表1(Table 1) 表2(Table 2)
天津同仁堂冠脉通片是治疗冠心病的中成药，由补肾与活血开窍方药构成，淫羊藿、桑寄生温补肾阳，枸杞子、何首乌滋补肝肾，红花活血通经，丹参活血祛瘀，石菖蒲、冰片醒神开窍，共奏补肾活血之功，用于肝肾不足、痰瘀阻络之胸痹。然而以往研究仅局限在对心肌和冠状动脉的改善作用观察[1-2]，进一步挖掘冠脉通片“补肾活血”中医治则对明确其临床定位具有重要意义。
血管钙化是慢性肾病（CKD）患者严重并发症，是导致CKD患者心血管疾病发病率和病死率明显升高的重要原因[3]。CKD血管钙化属于异位钙化，是由肾脏损及心血管的病理变化[4]，对应中医“肾虚血瘀”证候[5-6]，与冠脉通片补肾活血法的证治范围非常符合。因此，本实验通过建立CKD血管钙化大鼠模型，观察冠脉通片对CKD血管钙化的防治作用，为突显冠脉通片“补肾活血”的证治特色提供有力的研究手段。
1 材料 1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠60只，体质量160~180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物合格证编号：SCXK（京）2016-0006]。5只/笼饲养于屏障环境，室温（23±2）℃、相对湿度40%~70%，自由饮水，饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供[许可证号：SCXK（京）2014-0010]。
1.2 实验药物冠脉通片：0.3 g/片，由天津同仁堂集团股份有限公司提供（批号HP06001）；维生素D滴剂（VD3，胶囊型）：400 U/粒，由国药控股星鲨制药（厦门）有限公司生产（批号12973038）；维生素B4片：10 mg/片，由天津力生制药股份有限公司生产（批号1608008）。
1.3 试剂及仪器磷酸二氢钠（批号2017年7月5日）购自天津市风船化学试剂科技有限公司，总蛋白定量测试盒[二喹啉甲酸（BCA）法，货号A045-3]、钙试剂盒（货号C004-1）均购自南京建成生物工程研究所。
日立7080全自动生化仪（日本积水医疗科技有限公司），XHF-1高速分散器（上海金达生化仪器厂]，PL203电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，LDZ5-2低速自动平衡离心机（北京京立离心机有限公司），Infinite M200多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），ASP200S自动真空组织脱水机、EG1150H自动生物组织包埋机、RM2255切片机（德国Leica公司），Ci-L显微镜（日本Nikon公司）。
2 方法 2.1 动物分组及给药将雄性SD大鼠按体质量随机分为5组：正常组、模型组、VD3组（10 μL/只，相当于人用剂量的6倍）、冠脉通片0.46、0.23 g/kg组（相当于人用剂量的6、3倍），每组12只（2只备用）。造模当天开始给药，给药体积10 mL/kg，每日1次，连续10周。
2.2 CKD血管钙化模型的建立除正常组外，其余4组灌胃给予腺嘌呤200 mg/kg加高磷饮水制备CKD血管钙化模型。分组当天开始灌胃给予腺嘌呤溶液，给药体积10 mL/kg，每日1次，连续10周。正常组以等量纯净水对照处理。除正常组给予普通饮水外，其余4组均给予高磷饮水（0.5 g/只，2.5 g溶入500 mL饮用水中），每笼每日1瓶，连续10周。以硝酸银染色观察到血管钙化灶作为模型成立的评价标准。
2.3 指标检测 2.3.1 血清生化指标大鼠腹主动脉取血，冰上静置1 h，3 000 r/min离心10 min取血清，酶联免疫吸附法测定血清尿素、肌酐、钙和磷的水平。
2.3.2 血管钙含量测定剖取大鼠腹主动脉，生理盐水洗去血液，剔净脂肪。准确称取动脉组织（0.050±0.001）g，加入9倍体积生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆。2 500 r/min离心10 min取上清液，得10%组织匀浆。取20 μL 10%组织匀浆再用生理盐水按1:9稀释成1%组织匀浆，按总蛋白定量测试盒测总蛋白浓度；另取60 μL 10%组织匀浆按钙测试盒说明书测定钙含量。
2.3.3 肾脏和血管组织学病理检测剖取大鼠肾脏和胸主动脉，生理盐水洗去血液，10%中性甲醛固定。苏木精-伊红（HE）染色观察肾脏和血管组织的病理改变情况。
2.3.4 硝酸银染色观察血管钙化剖取大鼠胸主动脉，生理盐水洗去血液，10%中性甲醛固定。硝酸银染色观察血管钙化灶。
2.4 统计学方法采用SPSS 20.0软件分析实验数据，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 冠脉通片对大鼠血清尿素、肌酐、钙和磷水平的影响表 1显示，与正常组大鼠相比，模型组大鼠血清尿素、肌酐及磷水平明显升高（P < 0.01），钙水平明显降低（P < 0.01）。灌胃给药10周后，冠脉通片0.46、0.23g/kg组能显著降低模型大鼠血清尿素、肌酐及磷的含量（P < 0.01或P < 0.05），升高钙含量（P < 0.05），与VD3组比较，冠脉通片高、低剂量组未见统计学差异。
|
表 2显示，与正常组比较，模型组大鼠腹主动脉钙含量明显升高（P < 0.01）；与模型组相比，冠脉通片0.46、0.23 g/kg组腹主动脉钙含量显著降低（P < 0.01或P < 0.05）；与VD3组比较，冠脉通片高、低剂量组未见统计学差异。
|
正常组大鼠肾小球数目正常，未见纤维化及新月体等病变，肾小管上皮完好，未见变性、坏死及管型，肾间质未见炎症细胞浸润及纤维化。模型组肾小球结构紊乱，肾小管扩张，局部见棕褐色结晶沉积，肾脏间质弥漫淋巴和单核细胞浸润，大量成纤维细胞增生，形成广泛纤维化，肾脏血管明显减少。冠脉通片较模型组正常肾小球数目增多，肾小管扩张程度降低，炎性细胞数量下降，腺嘌呤结晶减少。其中，冠脉通片0.46 g/kg组效果更好。
3.4 冠脉通片对大鼠胸主动脉血管钙化的影响图 2显示，正常组大鼠胸主动脉内膜完整、中膜无异常；CKD血管钙化模型大鼠是钙化异位到胸主动脉，中膜可见明显的钙化结节且呈连续线性分布，硝酸银染色后可见黑色钙化灶呈连续性分布于胸主动脉。冠脉通片0.46、0.23 g/kg组大鼠胸主动脉钙化灶面积缩小，其中冠脉通片0.46 g/kg组效果更好。
|
|
| A：正常组；B：模型组；C：VD3组；D：冠脉通片0.46 g/kg组；E：冠脉通片0.23 g/kg组 图 1 冠脉通片对大鼠肾脏组织病理学的影响（HE，×200） Fig. 1 Effect of Guanmaitong tablets on renal histopathology in rats (HE, × 200) |
|
|
| A：正常组；B：模型组；C：VD3组；D：冠脉通片0.46 g/kg组；E：冠脉通片0.23 g/kg组。图中黑色箭头所示为钙化灶 图 2 冠脉通片对大鼠胸主动脉血管钙化的影响（×100） Fig. 2 Effect of Guanmaitong tablets on thoracic aorta calcification in rats (× 100) |
CKD血管钙化由矿物质骨代谢异常引起，属于CKD矿物质及骨代谢紊乱（CKD-MBD）的范畴[7]。运用中医病机分析，血管钙化归为“肾虚血瘀”范畴[8]。精血同源，元气根于肾，久病入络是肾虚血瘀形成的重要基础。《黄帝内经》 “骨萎”“骨枯”“骨痹”的记载，对应CKD-MBD的病理状态，清代王清任《医林改错》阐述了因虚致瘀的实质[9]。上述理论为冠脉通片补肾活血法防治CKD血管钙化奠定了理论基础。本课题组前期研究证实冠脉通片兼具补肾和活血双重作用，能明显改善肾阳虚大鼠的肾功能[10-11]。
本实验通过灌胃给予腺嘌呤加高磷饮水的方法构建CKD血管钙化大鼠模型。腺嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下转变成极难溶解于水的2，8-二羟基腺嘌呤，后者机械性阻塞肾小管，导致肾功能障碍[12]。高血磷是CKD患者发生血管钙化的直接危险因素。升高的血清磷诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转换、促进细胞凋亡以及激活氧化应激和炎症反应等多方面促进血管钙化[13]。模型组大鼠肾功能异常，肾脏组织病变明显，钙、磷代谢紊乱，胸主动脉钙化明显，说明CKD血管钙化模型复制成功。
维生素D3（VD3）在血管钙化的防治中发挥重要作用[14]。VD3缺乏导致钙、磷代谢紊乱及高甲状旁腺素水平，进而引发血管钙化。因此，本实验设置VD3为阳性对照药。CKD时，肾1α-羟化酶分泌减少，VD3合成受损，损害肠道钙吸收，导致低钙血症和继发性甲状旁腺功能亢进。甲状旁腺激素升高降低尿钙排泄，增加尿磷酸盐排泄，增加钙的骨吸收[15]。因此，CKD血管钙化大鼠模型血清钙水平降低而血管中钙含量增加。
冠脉通片能明显降低模型大鼠血清尿素和肌酐水平，改善肾组织病变程度，提示冠脉通片对CKD具有防治作用，体现了其补肾方药的作用；此外，冠脉通片能够纠正模型大鼠钙、磷代谢紊乱状态，降低腹主动脉钙含量，缩小胸主动脉钙化面积，提示冠脉通片对血管钙化的防治作用，体现了其活血开窍的作用。CKD血管钙化属于异位钙化，病理变化由肾及心。因此，冠脉通片虽然对血管钙化有直接的治疗作用，但有可能更侧重于通过CKD的治疗发挥对血管钙化的防治作用。
冠脉通片对CKD血管钙化有明显防治作用，突显了其“补肾活血”的证治特色，为扩大其临床适应症提供了有力的数据支持。
| [1] |
郝迪, 王瑞清, 沈宇燕, 等. 冠脉通片对实验性心肌梗死大鼠的保护作用及机制[J]. 中药药理与临床, 2015, 3(6): 128-132. |
| [2] |
张翠香, 刘建勋, 李丹, 等. 冠脉通片对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌酶及心肌细胞凋亡的影响[J]. 中医杂志, 2014, 55(20): 1760-1763. |
| [3] |
Wang XR, Zhang JJ, Xu XX, et al. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease:a systematic review and meta-analysis[J]. Ren Fail, 2019, 41(1): 244-256. DOI:10.1080/0886022X.2019.1595646 |
| [4] |
蒋娟, 孙源博, 王晓莉, 等. 慢性肾病患者血管钙化的研究进展[J]. 牡丹江医学院学报, 2018, 39(4): 98-100, 112. |
| [5] |
石凯峰.补肾活血方通过调控凋亡和自噬抑制慢性肾脏病大鼠血管钙化的作用及机制研究[D].北京: 中国中医科学院, 2017. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-84502-1017234460.htm
|
| [6] |
陆一竹, 姜智浩, 张琳, 等. 肾虚血瘀证与慢性肾病的相关性浅析[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2010, 11(9): 832-833. DOI:10.3969/j.issn.1009-587X.2010.09.030 |
| [7] |
潘海, 刘金鑫, 张岩. 慢性肾病合并矿物质与骨代谢紊乱的发病机制、临床诊断与治疗[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2014, 19(6): 695-700. |
| [8] |
郑在根, 郑洪新. 肾虚血瘀相关证候辨析[J]. 中国中医基础医学杂志, 2014, 20(6): 709-711. |
| [9] |
王清任. 医林改错[M]. 北京: 中国中医药出版社, 2011: 46.
|
| [10] |
苗淑杰, 王蕾, 吕楠, 等. 冠脉通片补肾活血法对大鼠肾阳虚心梗模型的拆方研究[J]. 中国中医基础医学杂志, 2017, 23(6): 783-786. |
| [11] |
吕楠, 沈宇燕, 刘洪斌, 等. 基于VDR及CYP27B1对冠脉通片拆方补肾活血作用靶点研究[J]. 天津中医药, 2017, 34(9): 629-633. |
| [12] |
郑龙飞, 韩玲, 郝宇, 等. 金匮肾气丸加味膏、汤方干预肾阳虚模型大鼠的药效学对比研究[J]. 北京中医药大学学报, 2018, 41(7): 567-571. DOI:10.3969/j.issn.1006-2157.2018.07.007 |
| [13] |
刘小锋, 何菂, 蔡嫣, 等. 高血磷诱导慢性肾衰患者血管钙化作用机制[J]. 生理科学进展, 2014, 45(1): 21-26. |
| [14] |
Hou YC, Lu CL, Zheng CM, et al. Emerging role of vitamines D and K in modulating uremic vascular calcification:the aspect of passive calcification[J]. Nutrients, 2019, 11(1): 152-165. DOI:10.3390/nu11010152 |
| [15] |
Reiss AB, Miyawaki N, Moon J, et al. CKD, arterial calcification, atherosclerosis and bone health:inter-relationships and controversies[J]. Atherosclerosis, 2018(278): 49-59. |
