天津同仁堂冠脉通片是治疗冠心病的中成药，由补肾与活血开窍方药构成，淫羊藿、桑寄生温补肾阳，枸杞子、何首乌滋补肝肾，红花活血通经，丹参活血祛瘀，石菖蒲、冰片醒神开窍，共奏补肾活血之功，用于肝肾不足、痰瘀阻络之胸痹。然而以往研究仅局限在对心肌和冠状动脉的改善作用观察^[1-2]，进一步挖掘冠脉通片“补肾活血”中医治则对明确其临床定位具有重要意义。

血管钙化是慢性肾病（CKD）患者严重并发症，是导致CKD患者心血管疾病发病率和病死率明显升高的重要原因^[3]。CKD血管钙化属于异位钙化，是由肾脏损及心血管的病理变化^[4]，对应中医“肾虚血瘀”证候^[5-6]，与冠脉通片补肾活血法的证治范围非常符合。因此，本实验通过建立CKD血管钙化大鼠模型，观察冠脉通片对CKD血管钙化的防治作用，为突显冠脉通片“补肾活血”的证治特色提供有力的研究手段。

1 材料 1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量160~180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物合格证编号：SCXK（京）2016-0006]。5只/笼饲养于屏障环境，室温（23±2）℃、相对湿度40%~70%，自由饮水，饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供[许可证号：SCXK（京）2014-0010]。

1.2 实验药物

冠脉通片：0.3 g/片，由天津同仁堂集团股份有限公司提供（批号HP06001）；维生素D滴剂（VD₃，胶囊型）：400 U/粒，由国药控股星鲨制药（厦门）有限公司生产（批号12973038）；维生素B₄片：10 mg/片，由天津力生制药股份有限公司生产（批号1608008）。

1.3 试剂及仪器

磷酸二氢钠（批号2017年7月5日）购自天津市风船化学试剂科技有限公司，总蛋白定量测试盒[二喹啉甲酸（BCA）法，货号A045-3]、钙试剂盒（货号C004-1）均购自南京建成生物工程研究所。

日立7080全自动生化仪（日本积水医疗科技有限公司），XHF-1高速分散器（上海金达生化仪器厂]，PL203电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，LDZ5-2低速自动平衡离心机（北京京立离心机有限公司），Infinite M200多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），ASP200S自动真空组织脱水机、EG1150H自动生物组织包埋机、RM2255切片机（德国Leica公司），Ci-L显微镜（日本Nikon公司）。

2 方法 2.1 动物分组及给药

将雄性SD大鼠按体质量随机分为5组：正常组、模型组、VD₃组（10 μL/只，相当于人用剂量的6倍）、冠脉通片0.46、0.23 g/kg组（相当于人用剂量的6、3倍），每组12只（2只备用）。造模当天开始给药，给药体积10 mL/kg，每日1次，连续10周。

2.2 CKD血管钙化模型的建立

除正常组外，其余4组灌胃给予腺嘌呤200 mg/kg加高磷饮水制备CKD血管钙化模型。分组当天开始灌胃给予腺嘌呤溶液，给药体积10 mL/kg，每日1次，连续10周。正常组以等量纯净水对照处理。除正常组给予普通饮水外，其余4组均给予高磷饮水（0.5 g/只，2.5 g溶入500 mL饮用水中），每笼每日1瓶，连续10周。以硝酸银染色观察到血管钙化灶作为模型成立的评价标准。

2.3 指标检测 2.3.1 血清生化指标

大鼠腹主动脉取血，冰上静置1 h，3 000 r/min离心10 min取血清，酶联免疫吸附法测定血清尿素、肌酐、钙和磷的水平。

2.3.2 血管钙含量测定

剖取大鼠腹主动脉，生理盐水洗去血液，剔净脂肪。准确称取动脉组织（0.050±0.001）g，加入9倍体积生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆。2 500 r/min离心10 min取上清液，得10%组织匀浆。取20 μL 10%组织匀浆再用生理盐水按1:9稀释成1%组织匀浆，按总蛋白定量测试盒测总蛋白浓度；另取60 μL 10%组织匀浆按钙测试盒说明书测定钙含量。

2.3.3 肾脏和血管组织学病理检测

剖取大鼠肾脏和胸主动脉，生理盐水洗去血液，10%中性甲醛固定。苏木精-伊红（HE）染色观察肾脏和血管组织的病理改变情况。

2.3.4 硝酸银染色观察血管钙化

剖取大鼠胸主动脉，生理盐水洗去血液，10%中性甲醛固定。硝酸银染色观察血管钙化灶。

2.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件分析实验数据，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 冠脉通片对大鼠血清尿素、肌酐、钙和磷水平的影响

表 1显示，与正常组大鼠相比，模型组大鼠血清尿素、肌酐及磷水平明显升高（P < 0.01），钙水平明显降低（P < 0.01）。灌胃给药10周后，冠脉通片0.46、0.23g/kg组能显著降低模型大鼠血清尿素、肌酐及磷的含量（P < 0.01或P < 0.05），升高钙含量（P < 0.05），与VD₃组比较，冠脉通片高、低剂量组未见统计学差异。

3.2 冠脉通片对大鼠腹主动脉钙含量的影响

表 2显示，与正常组比较，模型组大鼠腹主动脉钙含量明显升高（P < 0.01）；与模型组相比，冠脉通片0.46、0.23 g/kg组腹主动脉钙含量显著降低（P < 0.01或P < 0.05）；与VD₃组比较，冠脉通片高、低剂量组未见统计学差异。

3.3 冠脉通片对大鼠肾组织病理学的影响

正常组大鼠肾小球数目正常，未见纤维化及新月体等病变，肾小管上皮完好，未见变性、坏死及管型，肾间质未见炎症细胞浸润及纤维化。模型组肾小球结构紊乱，肾小管扩张，局部见棕褐色结晶沉积，肾脏间质弥漫淋巴和单核细胞浸润，大量成纤维细胞增生，形成广泛纤维化，肾脏血管明显减少。冠脉通片较模型组正常肾小球数目增多，肾小管扩张程度降低，炎性细胞数量下降，腺嘌呤结晶减少。其中，冠脉通片0.46 g/kg组效果更好。

3.4 冠脉通片对大鼠胸主动脉血管钙化的影响

图 2显示，正常组大鼠胸主动脉内膜完整、中膜无异常；CKD血管钙化模型大鼠是钙化异位到胸主动脉，中膜可见明显的钙化结节且呈连续线性分布，硝酸银染色后可见黑色钙化灶呈连续性分布于胸主动脉。冠脉通片0.46、0.23 g/kg组大鼠胸主动脉钙化灶面积缩小，其中冠脉通片0.46 g/kg组效果更好。

4 讨论

CKD血管钙化由矿物质骨代谢异常引起，属于CKD矿物质及骨代谢紊乱（CKD-MBD）的范畴^[7]。运用中医病机分析，血管钙化归为“肾虚血瘀”范畴^[8]。精血同源，元气根于肾，久病入络是肾虚血瘀形成的重要基础。《黄帝内经》 “骨萎”“骨枯”“骨痹”的记载，对应CKD-MBD的病理状态，清代王清任《医林改错》阐述了因虚致瘀的实质^[9]。上述理论为冠脉通片补肾活血法防治CKD血管钙化奠定了理论基础。本课题组前期研究证实冠脉通片兼具补肾和活血双重作用，能明显改善肾阳虚大鼠的肾功能^[10-11]。

本实验通过灌胃给予腺嘌呤加高磷饮水的方法构建CKD血管钙化大鼠模型。腺嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下转变成极难溶解于水的2，8-二羟基腺嘌呤，后者机械性阻塞肾小管，导致肾功能障碍^[12]。高血磷是CKD患者发生血管钙化的直接危险因素。升高的血清磷诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转换、促进细胞凋亡以及激活氧化应激和炎症反应等多方面促进血管钙化^[13]。模型组大鼠肾功能异常，肾脏组织病变明显，钙、磷代谢紊乱，胸主动脉钙化明显，说明CKD血管钙化模型复制成功。

维生素D₃（VD₃）在血管钙化的防治中发挥重要作用^[14]。VD₃缺乏导致钙、磷代谢紊乱及高甲状旁腺素水平，进而引发血管钙化。因此，本实验设置VD₃为阳性对照药。CKD时，肾1α-羟化酶分泌减少，VD₃合成受损，损害肠道钙吸收，导致低钙血症和继发性甲状旁腺功能亢进。甲状旁腺激素升高降低尿钙排泄，增加尿磷酸盐排泄，增加钙的骨吸收^[15]。因此，CKD血管钙化大鼠模型血清钙水平降低而血管中钙含量增加。

冠脉通片能明显降低模型大鼠血清尿素和肌酐水平，改善肾组织病变程度，提示冠脉通片对CKD具有防治作用，体现了其补肾方药的作用；此外，冠脉通片能够纠正模型大鼠钙、磷代谢紊乱状态，降低腹主动脉钙含量，缩小胸主动脉钙化面积，提示冠脉通片对血管钙化的防治作用，体现了其活血开窍的作用。CKD血管钙化属于异位钙化，病理变化由肾及心。因此，冠脉通片虽然对血管钙化有直接的治疗作用，但有可能更侧重于通过CKD的治疗发挥对血管钙化的防治作用。

冠脉通片对CKD血管钙化有明显防治作用，突显了其“补肾活血”的证治特色，为扩大其临床适应症提供了有力的数据支持。