肺闭宁颗粒是以天津市儿童医院名老中医的经验处方为基础，经工艺改良后制成的医院制剂（津药制字Z20070308），由黄芩、枳壳、麻黄、川贝母、桔梗、人参等中药组成，具有宣肺解热、化痰定喘之功效，具有多年的临床应用基础。

儿童的呼吸道免疫功能较差，且呼吸道纤毛运动比较差，不能有效地清除尘埃和异物，因此儿童更容易患呼吸道感染。随着季节变迁、大气污染的加重，儿童呼吸道感染的机会大大增多。尤其是近年来，受雾霾天气影响，据统计儿科门诊中儿童呼吸道感染占39%~65%，儿科住院部肺炎患病率最高，约占25%~65%，因此儿童呼吸系统疾病一直以来都备受业内人士的关注。

本研究采用二氧化硫引咳小鼠模型、内毒素诱导的肺损伤小鼠模型以及斑马鱼PM2.5超细颗粒物排出模型，在给予不同浓度的肺闭宁颗粒干预后，观察其止咳、抗炎以及对纳米颗粒从斑马鱼体内排出进入肠道的影响，观察肺闭宁颗粒止咳、抗炎及对抗PM2.5损伤方面的作用，评价其在对抗雾霾天气引起的呼吸道系统疾病治疗中的潜力，为其临床应用提供数据支持。

1 材料与方法 1.1 实验仪器与主要试剂

解剖显微镜（SMZ645，Nikon公司）、6孔板（Nest Biotech）、精密电子天平（CP214，奥豪斯）、显微注射仪（IM-300，Narishige）、拉针仪（PC-10，Narishige，Japan）。纳米活性炭（ACNP，粒径200 nm，军事医学院科学院毒物药物研究所）；脂多糖（LPS，Sigma，货号：L2880）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，碧云天，货号：C0221A）、白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附（ELISA）法检测试剂盒（R&D，货号：VAL604）。

1.2 实验动物

ICR小鼠，雌雄各半，体质量16~18 g，购于北京维通利华公司，动物合格证号：11400 700211245。黑色素等位基因突变型（Albino）品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2 d，共150尾。

1.3 受试药物

1）肺闭宁颗粒：天津市儿童医院，批号：20160501；2）急支糖浆：太极集团涪陵制药厂，批号：15100924；3）双黄连注射剂：河南福森药业有限公司，批号：1606062。

2 实验方法 2.1 对二氧化硫引咳小鼠模型的改善作用 2.1.1 二氧化硫气体的制备

用250 mL的侧口烧瓶，侧口用橡皮管连接球胆，瓶内放亚硫酸钠。烧瓶塞上装1个分液漏斗，内放浓硫酸。打开分液漏斗的活塞，浓硫酸滴下后在瓶内产生二氧化硫气体，储存于球胆内备用^[1]。

2.1.2 分组给药及模型制备

ICR小鼠50只，雌雄各半，体质量16~18 g，随机分成5组，分别为对照组、急支糖浆组（4.5 mL/kg）、肺闭宁颗粒低（1.85 g/kg）、中（3.69 g/kg）、高（7.38 g/kg）剂量组。分别按剂量灌服药液，对照组灌服等量饮用水，每日1次，连续灌服3 d。末次给药1 h后，将小鼠放入密封的钟罩内（5 000 mL），注入20 mL二氧化硫气体。立刻计时，刺激3 min，记录小鼠开始咳嗽的时间为咳嗽潜伏期。取出小鼠放入大烧杯内，继续观察20 min，并记录0~10 min、10~20 min小鼠的咳嗽次数^[1]。

2.2 对内毒素诱导小鼠肺损伤的保护作用

ICR小鼠60只，雌雄各半，体质量16~18 g，随机分成6组，即对照组、模型组、双黄连组、肺闭宁颗粒低（1.85 g/kg）、中（3.69 g/kg）、高（7.38 g/kg）剂量组。除对照组、模型组给予等量饮用水外，其他各组均灌胃给与相应药物。每日1次、连续灌服3 d。末次给药后1 h，用4%的水合氯醛、0.01 mL/g对小鼠进行腹腔注射。除对照组外，其他各组在聚光灯下拉出小鼠的舌根（用0.9%氯化钠溶液浸润的纱布包绕小鼠舌尖轻轻将其拉出，避免对小鼠的损伤）以暴露声门，直视下将22 G穿刺套管针轻推进入气管，随即用1 mL的注射器向气管内快速注入l g/L的LPS 50 μL，紧接让小鼠置于垂直于地面的位置，并旋转0.5~1 min，使LPS均匀地分布在肺内。对照组气管内注入50 μL PBS。造模24 h后，每组的8只小鼠用总体积1.8 mL预冷的PBS等分3次进行肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液样品离心（3 000 r/min，4 ℃）10 min，进行相关炎症因子IL-6的测定；其余8只小鼠取肺称取质量，在60 ℃的烘箱中干燥48 h，进行肺组织湿干重（W/D）比率、肺指数的测定^[2-4]。

2.3 对斑马鱼PM2.5超细颗粒物排出模型改善作用

随机选取150尾受精后2 d（2 dpf）黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，分成5组，即正常组（不注射活性炭纳米颗粒）、模型组、肺闭宁颗粒低、中、高剂量组。将2.3 mg/mL纳米活性炭作为PM2.5纳米颗粒，注射到2 dpf斑马鱼卵黄囊中（相当于人肌肉注射），每尾斑马鱼注射30 nL，即以69 ng/尾剂量建立斑马鱼PM2.5排出模型。每孔均处理30尾斑马鱼，肺闭宁低、中、高剂量组分别水溶给予13.9、41.7和125 mg/mL浓度的肺闭宁颗粒，并且每日更换药液，正常组和模型对照组只换养鱼水。药物处理6 d后，统计体内纳米活性炭排出进入肠道的斑马鱼数量[Z（纳米颗粒排出进入肠道）]，与该组斑马鱼总数[Z（总数）]求得比值，计算排出发生率^[5]。纳米活性炭排出发生率计算公式：

2.4 统计学方法

采用Excel 2003建立数据库，SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组独立样本均数比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用LSD法，计数资料以率表示，组间比较采用χ²检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果 3.1 对二氧化硫引咳小鼠模型的改善作用

实验结果显示，急支糖浆组与肺闭宁颗粒高剂量组可以延长二氧化硫引咳小鼠咳嗽潜伏期，与对照组比较具有统计学意义（P＜0.05），表明该药有较好的止咳作用。急支糖浆组与高、中剂量的肺闭宁颗粒可不同程度减少各时间段小鼠的咳喊次数，与对照组比较具有统计学差异（P＜0.01），并且呈一定的量效关系，结果见表 1。

3.2 对内毒素诱导小鼠肺损伤的保护作用

小鼠LPS染毒24 h后，聚堆并且懒于活动，抓取时逃避无力，ELISA实验结果显示，模型组小鼠肺泡灌洗液中IL-6的生成水平显著高于对照组，说明造模成功。与模型组比较，双黄连组、肺闭宁颗粒中、高剂量组可降低IL-6浓度（P＜0.05），具有一定的抗炎效果，在肺指数及肺组织W/D比率方面没有明显的改善效果。见表 2。

3.3 对斑马鱼PM2.5超细颗粒物排出模型改善作用

实验结果显示：肺闭宁颗粒125 mg/mL时，纳米活性炭排出发生率为63.3%，与模型组（16.7%）比较，具有统计学差异（P＜0.05），显示肺闭宁颗粒在125 mg/mL浓度时对斑马鱼纳米活性炭排出进入肠道有明显的促进作用。见表 3和图 1。

曲线所圈范围为斑马鱼肠道；模型组、肺闭宁颗粒低、中剂量组图中箭头所指为肠道外的纳米活性炭，肺闭宁颗粒高剂量组图中箭头所指为肠道内的纳米活性炭

4 讨论

雾霾污染是非常严重的公共卫生问题，是严重危害人类健康的大气环境污染，困扰着中国大部分城市和地区。其中细颗粒物（特别是PM2.5）是对人体健康造成严重威胁的重要致病物质。尤其对于儿童，国内外的长期跟踪研究发现，短期暴露于高PM2.5的环境中，将会导致儿童肺功能的改变及哮喘的发病率增加，而长期暴露将会诱发儿童的慢性呼吸系统疾病，与由呼吸系统疾病所导致的新生儿后期病死率相关。目前预防雾霾的措施主要是利用防雾霾口罩来减少细颗粒雾的吸入，从而达到降低雾霾危害的目的。在此基础上，促进已吸入体内的PM2.5排出，将对预防和降低雾霾天气对人机体造成的损伤具有重大的临床意义。

肺闭宁颗粒源于临床经方，具有宣肺解热、化痰定喘功效。主治哮喘性支气管炎、支气管肺炎，在临床上有多年的应用基础，深受广大患者的认可。在剂量选择上，按照肺闭宁颗粒说明书所示，3岁以上儿童每日用量9 g，通过使用等效剂量换算系数进行折算作为实验动物高剂量组的给药依据，并逐级建立了中、低剂量组。本研究采用二氧化硫引咳小鼠模型、内毒素诱导的肺损伤小鼠的经典模型进行研究，肺闭宁颗粒为天津市儿童医院经典中药复方制剂，相比于西药，在临床应用中具有多途径、多靶点的特点。本研究选择了有大量文献报道^[6-7]、已经在临床中取得了良好治疗效果的中药复方制剂（急支糖浆和双黄连注射液）作为阳性对照药。

本研究除应用了经典的止咳及抗炎模型，还采用了较为新颖的斑马鱼PM2.5超细颗粒物排出模型对肺闭宁颗粒进行药效学评价。斑马鱼作为模型动物，具有与人类基因同源性高（80%以上）、高通量、快速、费用低等特点，近年来广泛用于药物药效作用的筛选及早期毒性筛选研究中。由于PM2.5超细颗粒物的尺寸和成分复杂，直接使用大气中收集的超细颗粒物进行研究较为困难，因此研究者多采用纳米颗粒代替PM2.5超细颗粒物进行研究^[8]。很多研究通过跟踪纳米颗粒的体内代谢过程，发现纳米颗粒除了可以通过从肺部^[9]、肝脏^[10]等部位清除外，还可通过肠道排出体外^[11]。Zhao等^[12]的研究进一步证明了进入斑马鱼和小鼠体内的纳米活性炭颗粒都能通过肠道的杯状细胞分泌代谢进入肠道而排出，被称为肠杯状细胞分泌通路（IGCSP）。由于斑马鱼胚胎透明易于直接观察，本研究利用IGCSP，设计了对斑马鱼卵黄囊内注射纳米活性炭颗粒制备斑马鱼PM2.5超细颗粒物排出模型，评价肺闭宁颗粒对体内PM2.5超细颗粒物排出的影响。

本实验结果显示肺闭宁颗粒可明显减少二氧化硫引咳模型小鼠咳嗽潜伏期时间及咳嗽次数，可降低内毒素诱导的肺损伤小鼠肺灌流液中IL-6浓度，促进斑马鱼模型PM2.5超细颗粒物排出。提示其在对抗雾霾天气引起的呼吸道系统疾病治疗中，在减少PM2.5对人机体损伤方面具有一定的效果，为其临床应用提供了实验数据支持。