糖尿病肾病（DN）发病率逐年上升，伴随病程进展导致的终末期肾衰往往是该病的结局。DN患者无论病情轻重大多存在蛋白尿的临床症状，蛋白尿的产生、发展及肾小球硬化程度与足细胞数目减少和密度降低密切相关。足细胞终末分化的特性决定其损伤丢失后几乎不可再生，作为肾小球滤过膜的关键屏障，高糖导致的足细胞凋亡会直接影响及细胞毛细血管壁的选择通透性加重肾损伤，因此成为DN发生发展的最主要受累靶细胞。细胞凋亡是足细胞损伤丢失的主要原因，而自噬可能是细胞自体减少凋亡发挥自身保护作用的主要机制。细胞自噬具有双面调节性，保护性及损伤性作用根据细胞种属的不同而不同，研究显示肾脏中足细胞的自噬水平较其他细胞高^[1]。基于自噬和细胞凋亡的关系，进一步探讨通络益肾方能否通过启动自噬有效降低体外高糖诱导的小鼠肾足细胞（MPC-5）凋亡对肾小球滤过屏障起保护作用，使该方在临床控制DN病情恶化、减少蛋白尿及肾小球硬化程度的分子水平得到印证。

1 材料与方法 1.1 实验动物与细胞

成熟无特定病原体（SPF），SD雄性大鼠40只（许可证号：SCKK（陕）2017-003，合格编码：61001700002816），由西安交通大学实验动物中心提供，体质量180~220 g。

MPC-5小鼠肾足细胞株（编号：BNCC337685，由北纳生物科技有限公司提供），增殖结束后置于37 ℃恒温，含5%CO₂培养箱中孵育，培养基由红变黄后使用胰蛋白酶消化，按照1:3传代，继续培养至显微镜观察细胞呈长梭形上皮细胞样，有星形树枝状突起，符合文献报道特征，进行后续实验。

1.2 实验药品、试剂

通络益肾方由生地、山茱萸、山药、茯苓、制附子、泽泻、水蛭、全蝎、桃仁、酒大黄组成，全部药材经陕西中医药大学附属医院中药房提供并鉴定，药材质量达标。生药材按照30:15:15:12:10:12:6:10:12:10比例，分高、中、低（4.76 g/mL、2.38 g/mL、1.19 g/mL）剂量购买所需生药材。0.9%生理盐水购买于西安交通大学第一附属医院西药房。

胎牛血清（美国Hyclone公司，SV30087.02）；1640培养基无糖、无HEPES（美国Hyclone公司，11879020）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，AR0146）；沉默信息调节因子1（SIRT1）、B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3（bcl-2/BNIP3）一抗（美国Abcam公司，ab189494、ab109362）；Bcl-2相关X蛋白（Bax）、P62蛋白（P62）一抗（美国CST公司，3498S、23214S）；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，CA1020-100T）；羊抗兔二抗100 μL（武汉博士德生物工程有限公司，BA1054）；Hoechst33342（北京索莱宝科技有限公司，C0030）。

1.3 主要仪器

尼康倒置光学显微镜（型号：SMZ745，上海普赫生物科技有限公司）；流式细胞仪（型号：FACS Calibur，美国BD公司）；恒温细胞培养箱（Forma3111型，美国Thermo公司）；超净细胞工作台（型号：SW-CJ-2FD，苏净科学器材有限公司）。

1.4 实验方法 1.4.1 含药血清制备

成熟SPF级SD雄性大鼠40只，随机每组10只分为正常组、通络益肾方高、中、低剂量组4组。中药制剂根据人与大鼠体表面积折算系数最终按照4.76、2.38、1.19 g/mL药物浓度分高、中、低剂量。大鼠连续给药10 d，每日按2 mL灌胃。正常组取0.9%生理盐水等剂量灌胃。于末次给药2 h后，腹主动脉取血，血清过滤分装后-20 ℃保存待用。

1.4.2 细胞分组及给药

将细胞快速复苏后接种于9:1:0.1（DMEM培养液:胎牛血清:青霉素链霉素混合液）比例配制细胞培养液中，37 ℃、5%CO₂培养条件培养，每2~3 d换液1次，待细胞分化成熟，倒置显微镜观察大体呈鹅卵石样形态，末端有分枝，接种于6孔板中融合至80%~90%，改用含1%胎牛血清培养液使细胞饥饿6~8 h后分6组加药干预。正常组：5.6 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清；高糖组：30 mmol/L葡萄糖+10%正常大鼠血清；通络益肾方高、中、低剂量组：30 mmol/L葡萄糖+10%高、中、低剂量含药血清组，高渗组：甘露醇24.5 mmol/L+10%正常大鼠血清；细胞干预48 h胰蛋白酶消化收集细胞，进行指标检测。

1.4.3 Hoechst33342观察细胞凋亡

细胞按照分组依次种于6孔板，密度达60%~70%，加药干预。48 h后PBS清洗掉杂质及死细胞，4%多聚甲醛固定液常温固定15 min，去除固定液后再次清洗。6孔板每孔加入500 μL Hoechst33342荧光染料，室温反应20 min，封片染色后直接置于荧光显微下观察。

1.4.4 Annexin V-FITC/PI双染检测足细胞凋亡率

Annexin V/PI双染可以反应药物干预后的细胞生长状态从而区分凋亡早期和晚期细胞，首先用去离子水按照9:1稀释Binding Buffer（10×）备用。15 mL离心管先收集细胞上清液加贴壁细胞，混均后800 g离心5 min弃培养基，向上清细胞和贴壁细胞混液中各加入500 μL Binding Buffer重悬，移至同一离心管使细胞密度达到1×10⁶个。1.5 mL EP管中吸入100 μL细胞，先加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，室温避光孵育10 min，再加入5 μL PI同上反应5 min，反应结束后加入390 μL PBS，混匀后上机检测。

1.4.5 Western Blot检测自噬标志蛋白SIRT1、P62及促凋亡蛋白BNIP3、Bax表达

蛋白样品提取全程冰上操作，清洗并离心收集细胞，放入1.5 mL EP管中加入配制好的RIPA裂解液枪头反复抽打充分裂解裂解30 min，4 ℃ 10 000 g/5 min离心去除气泡，吸出上清，并计算量。使用BCA法测定蛋白浓度，96孔板设置两个复孔，依次加入标准品BSA、蛋白样品、纯水。计算出所需BCA工作液的体积配制待用，加入工作液后37 ℃孵育30 min酶标仪定量，最后加入上样缓冲液，煮沸后-80 ℃保存待用。根据蛋白分子量配制相应浓度分离胶、浓度胶，蛋白上样后80 V/30 min，110 V/90 min电泳，然后快速转膜，TBST洗膜3遍每次10 min，封闭2 h，孵一抗，4 ℃过夜。洗膜后孵二抗，置摇床2 h，ECL显色。利用Image Pro Plus6软件凝胶成像分析灰度值，并以β-actin为内参计算各蛋白表达强度的变化，分析灰度值结果。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据统计，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 流式细胞仪检测足细胞凋亡率

各组细胞凋亡率数据分析以P＜0.05具有统计学意义；与正常组细胞相比，高糖组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），高渗组细胞凋亡率无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；与高糖组相比，通络益肾方中剂量组细胞凋亡率显著改善，有统计意义（P＜0.01），通络益肾方低剂量组细胞凋亡率也有所下降（P＜0.05），但改善效果不如中剂量组，通络益肾方大剂量组细胞凋亡率无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 1、表 1。

2.2 Hoechst33342凋亡染色结果

Hoechst33342染色图片可见正常组和高渗组荧光图片蓝染较淡，细胞均匀椭圆弥散，细胞核基本无强荧光点聚集，高糖组细胞凋亡最多，细胞核呈团块碎裂，染色质皱缩发出致密或碎块状强靛蓝光。通络益肾方中剂量组、低剂量组与高糖组相比凋亡细胞数量有所下降，中剂量方效果最佳，高剂量组因药物浓度大对细胞有毒性，细胞足突融合导致细胞贴附能力下降，荧光图片显示细胞不均匀分布，视野内满布强荧光团，呈现凋亡细胞典型特征。见图 2。

2.3 足细胞SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白表达

蛋白印迹结果显示，与正常组相比，高糖组SIRT1蛋白表达下降，BNIP3、P62、Bax蛋白表达升高（P＜0.05或P＜0.01），差异有统计学意义。与高糖组相比，通络益肾方中、低剂量组SIRT1蛋白表达升高，BNIP3、P62、Bax蛋白表达下降（P＜0.05或P＜0.01），说明治疗有意义。高剂量组SIRT1、BNIP3、P62、Bax蛋白表达未见明显改变（P>0.05），差异无统计学意义。见表 2、图 3。

3 讨论

通络益肾方治疗糖尿病肾病是本实验室近几年的重点研究课题，中医理论认为DN是糖尿病迁延日久耗气伤阴久则病理产物痰、热、瘀、毒损脾、肾，耗五脏而形成。基于DN动态变化的病机基础，杜雨茂^[2]教授总结多年临证经验发现本虚标实，肾虚络瘀毒蕴贯穿DN始末，针对这种虚实并见的复杂病理特点，立法滋阴温阳，解毒通络（通肾络、益脾肾），治疗上选用肾气丸、抵当汤合方化裁的通络益肾方治疗。全方组方灵活滋阴助阳之中意蕴通络解毒之效，消补兼施之则适用肾亏阴阳两虚，毒瘀阻络证。方中生地、山药、山茱萸、制附子、泽泻、茯苓共奏益脾肾之功。肾为水火之脏，《素问》有“肾者主蛰”之说，肾藏精阴阳充沛对其气化、固摄、封藏职能的正常发挥，有着举足轻重的作用，生地滋肾阴，制附子助肾阳，阴阳兼顾之中巩固了肾脏封藏功能；山药、泽泻、茯苓补脾兼渗湿，补而不滞；山茱萸一能收敛固涩、二与生地配伍益肾阴，六药配伍能兼顾先后天，先天的职能得以正常发挥，后天的遗失能迅速回补，减少蛋白尿、水肿症状的同时补益了久病亏耗之体。全蝎、水蛭、大黄、桃仁共施泄浊排毒化瘀之功，共祛肾络实邪。本课题前期研究从临床观察、动物及微观细胞实验等多角度、全面证实了该方能减轻患者临床症状、延缓肾小球硬化周期及减少尿蛋白，改善DN大鼠肾脏功能、病理及生化指标，分子水平深入探究证实该方还具有对抗内质网应激抑制系膜细胞增殖、凋亡^[3-4]、稳定足细胞骨架等作用^[5]。前期的研究基础为本课题的开展奠定了基础。

糖尿病肾病足细胞黏附能力下降、密度、数量减少和进行性功能丧失是导致肾小球滤过膜通透性改变从而加速蛋白尿发生发展的重要因素^[6]，高糖导致的凋亡是其丢失的关键。因此保护足细胞抑制其凋亡成为该病防护和治疗的切入点。自噬是真核细胞应对复杂生理和营养缺乏、炎症刺激、氧化应激等病理过程的保护性防御机制，基础水平的自噬可程序性降解受损细胞器、清理大分子物质及错误折叠蛋白质为细胞自我修复、更新提供原料，从而维持细胞稳态。最初研究认为凋亡与自噬是隶属于程序性细胞死亡下截然不同的两种细胞死亡方式，分别为Ⅰ型和Ⅱ型^[7]。随着研究的深入发现它们在某些通路上因受共同的蛋白调节而存在密切的联系。同种病理、生理条件刺下因强度的不同或激发自噬或启动调亡^[8]。DN时足细胞在高糖等因素刺激下，既可通过自噬清除废弃的蛋白和细胞器，也可出现细胞凋亡，在不同时期，自噬和凋亡的活性可能出现变化。查阅文献总结两者的关系为以下几个方面，位居上游的自噬启动凋亡并影响凋亡的程度^[9]。自噬可通过多途径维持细胞内环境稳定抑制细胞凋亡^[10]。因自噬具有双重性，两者可相互转换，在复杂的细胞内部或协同促进细胞死亡或寻找调控双方的稳态平衡^[11]。黄贵华等^[12]从中医理论阐述自噬，称其为脏腑功能失调久致机体正虚邪实，机体为维持阴阳平衡状态的自救方式。因此，深入探究自噬与凋亡关系在调节足细胞的病理生理过程中有着重要的意义。检测技术及中医药事业的的迅猛发展为大家深入研究不同疾病，不同病期综合防治DN提供了新途径、新思路^[13-14]。

自噬标志蛋白SIRT1、P62能够启动自噬恢复高糖培养的肾脏细胞内部能量稳态重建阻止DN发生和发展^[15-16]。研究表明其参与DN病理、生理进程，通过多途径发挥细胞保护作用可成为防治DN的新靶点^[17-18]。BNIP3属于Bcl-2亚家族，与Bax均被称为促细胞凋亡的中心调控蛋白，在凋亡中的研究比较透彻，近年发现BNIP3不仅影响凋亡还能激活线粒体自噬^[19]。本实验研究发现正常组足细胞中自噬标志蛋白SIRT1的表达量较高，而在高糖刺激下的足细胞内表达降低，通络益肾方含药血清中、低剂量干预组细胞内SIRT1的蛋白表达量较高糖组增高，说明该方可诱导高糖刺激下的足细胞自噬，提高自噬水平，保护细胞。而BNIP3、P62和Bax蛋白在正常组足细胞中的蛋白表达变化与SIRT1完全相反表达低，高糖刺激下的足细胞内表达升高，利用中药中、低剂量含药血清干预后，细胞内促凋亡蛋白BNIP3、Bax和P62蛋白表达量较高糖组降低。而后又利用流式细胞仪及荧光染色对各组足细胞凋亡检测发现，中药含药血清中、低剂量干预组足细胞凋亡率较高糖组有所改善，说明通络益肾方中、低剂量含药血清对高糖刺激的足细胞有保护作用，且小剂量组效果不及中剂量组，印证了该方中医治疗DN的有效性及发挥作用的机制。该实验中Western blot结果显示BNIP3/β-actin和Bax/β-actin在高糖组细胞中表达量为（0.64±0.04）和（1.29±0.03），在高剂量组为（0.65±0.04）、（1.33±0.11），与高糖组相比，统计分析后发现促凋亡蛋白在高剂量组中表达未下降，自噬标志蛋白SIRT1、P62变化也不具统计学意义。流式细胞仪结果显示高糖组足细胞凋亡率为19.03%，高剂量组为18.55%，高剂量含药血清对高糖培养的足细胞凋亡率未能改善。结果证实高剂量含药血清不能通过改变自噬降低足细胞凋亡率，保护足细胞，延缓死亡。

目前的研究仅证明通络益肾方能够调节足细胞自噬、凋亡的代表性蛋白，升高或降低其表达，保护高糖培养的足细胞，减少其凋亡率，但并不能在分子机制上确切证实其因果关系。高剂量组含药血清对足细胞凋亡率未改善，与高糖组相比不能升高或降低自噬标志蛋白SIRT1、P62及促凋亡蛋白BNIP3、Bax表达，可能与该方中解毒通络药物桃仁、酒大黄、水蛭、全蝎的使用有关，后期将对该方进行拆解，探究是否与解毒通络药物的使用有关。后续将对本课题进行更加深入的研究，基于自噬的某一条经典通路，利用基因敲除技术，敲除或降低自噬关键蛋白或因子，探讨通络益肾方是否仍能保护足细胞，降低凋亡率。并将该方与西药组作对比，比较治疗效果，进一步为DN的中医诊疗提供依据，明确通络益肾方治疗DN的确切机制。