补骨脂为豆科植物补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果实，主要产自云南、四川等地，是中国传统中药，临床应用广泛。补骨脂其性辛、苦，温，归肾、脾经，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效^[1]。近年来研究表明，补骨脂在抗肿瘤^[2]、抗氧化^[3]、抗菌^[4]、抗炎^[5]、调节雌激素水平^[6]等方面均具有显著的药理作用。补骨脂盐炙法收录于2015版《中华人民共和国药典》，补骨脂经盐炙可增强止泻作用，降低燥性，降低毒副作用^[1]。

现有的化学对照品、对照提取物无法完全反映出中药饮片科学内涵与特征属性^[7]。作为国家药品标准物质，中药标准饮片的研究具有重要的意义。标准饮片的均匀化制备直接影响其内涵特征的表达，其中粉碎工艺的优化是标准饮片均匀化过程的重要环节之一^[8]。补骨脂饮片粉末化研究有利于补骨脂饮片的质量监管。本文采用不同目数药筛制备不同粒度的补骨脂饮片粉末，对其粉末分布及指标成分含量差异进行研究，并以粉碎时间、粉碎次数、投料量为因素，借鉴蛛网模式的研究方法^[9-10]，通过出粉率、主要成分的总含量计算归一化面积（S），采用正交实验法以S为指标对影响因素进行研究，优选最佳粉碎工艺，为制定补骨脂标准饮片粉末均匀化工艺的技术规范提供参考依据。

1 材料与仪器 1.1 仪器

超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY^TM UPLC system（美国沃特世公司），XS 205型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），AL 204型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），SCIENTZ SB 25-12DTN型超声波清洗器（宁波新芝生物有限公司，功率：300W，频率：40 kHz），TGL-16C型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司），FW80粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），微量进样器（平头10 μL，上海高鸽工贸有限公司），硅胶G板（200 mm×100 mm，青岛海洋化工分厂）。

1.2 药品及试剂

对照品：补骨脂素（批号：110738-201313）、异补骨脂素（批号：110739-201115）购自中国食品药品检定研究院，纯度为＞98%；补骨脂苷、异补骨脂苷（实验室自制，NMR、MS鉴定化合物结构，UPLC-UV分析纯度＞98%）。甲醇、甲酸均为色谱纯，食用盐，水为超纯水。

生补骨脂：补骨脂药材购自河北安国药材市场；盐补骨脂：严格按照2015版《中华人民共和国药典》盐炙法（通则0213）炮制。

补骨脂是生补骨脂和盐补骨脂的统称；补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素分别简写为PO、IPO、P、IP。

2 方法 2.1 色谱条件

超高效液相色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇（B）-0.1%甲酸水（A）溶液，梯度洗脱（0~6 min，90% → 40% A）；柱温：60 ℃；流速：0.3 mL/min；检测波长：246 nm；进样量：2 μL。

薄层色谱条件：按照2015版《中华人民共和国药典》中薄层色谱法（通则0502）实验，吸取样品和对照品溶液各2~4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.2 对照品溶液的配制

分别取PO、IPO、P、IP各5 mg，精密称定，加甲醇配制成每1 mL分别含有PO 0.798 mg、IPO 1.018 mg、P 1.140 mg、IP 1.284 mg的储备液，供定量分析用。

分别取P、IP对照品2 mg，精密称定，加乙酸乙酯配制成每1 mL含P、IP各1 mg的混合对照品溶液，供薄层鉴别用。

2.3 供试品溶液的制备

取补骨脂粉末0.5 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇适量，密塞，60 ℃超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，甲醇定容至刻度，摇匀，14 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加1 mL 30%甲醇水溶液（V:V），摇匀，供定量分析用^[9]。

取补骨脂粉末0.5 g，精密称定，置50 mL三角瓶中，加乙酸乙酯20 mL，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，供薄层鉴别用^[1]。

2.4 补骨脂饮片粉碎工艺正交实验研究

以出粉率、指标成分的总含量为指标，借鉴蛛网模式的研究方法^[10-11]，优选最佳粉碎工艺。生补骨脂和盐补骨脂中出粉率为Ga和G'a；PO、IPO、P、IP的总量为Za和Z'a，其中a为不同粉碎方式（9个正交实验组，a为1~9）的补骨脂饮片粉末样品。

为了消除不同指标取值范围差异对统计结果的影响，对不同指标的变量进行归一化处理。生补骨脂和盐补骨脂样品中最大出粉率为Ga（max）和G'a（max）；PO、IPO和P、IP的最高总含量为Za（max）和Z'a（max）。将不同指标的数值分别除以该指标的最大值，得到出粉率的归一化结果分别为Qa和Q'a，PO、IPO和P、IP总量的归一化结果分别为Ha和H'a。计算公式1、2如下所示。

(1)

(2)

通过计算Qa和Ha（Q'a和H'a）构成的阴影部分面积，优选生补骨脂和盐补骨脂饮片的最佳粉碎方式，其归一化面积分别为S和S'，计算公式3、4如下所示。

(3)

(4)

2.5 生补骨脂和盐补骨脂饮片最佳粉碎工艺验证研究

取生补骨脂和盐补骨脂，采用补骨脂最佳粉碎工艺制备补骨脂标准饮片粉末，计算出粉率；按“2.3”项下方法制备补骨脂饮片粉末供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定供试品溶液中PO、IPO、P、IP的含量。

3 结果 3.1 补骨脂饮片的粉末分布及其指标成分的含量变化研究

分别取生补骨脂和盐补骨脂各100 g，粉碎机单次粉碎20 s，采用《中国药典》规定的标准药筛制备不同目数的粉末，称取不同药筛上未通过该药筛的样品粉末质量，分别计算其比例，结果见表 1。按“2.3”项下方法处理样品A~H（生补骨脂饮片粉末）和样品A'~H'（盐补骨脂饮片粉末），分别制备供定量分析用与供薄层鉴别用的样品溶液，按“2.1”项下薄层色谱条件鉴别不同粒度的补骨脂饮片粉末，结果见图 1。按“2.1”项下色谱条件测定供试品溶液中PO、IPO、P、IP的含量，结果见图 2。

表 1结果显示，100%补骨脂饮片粉末通过10目筛，89.02%生补骨脂粉末和97.34%盐补骨脂粉通过24目筛，56.24%生补骨脂粉末和62.40%盐补骨脂粉通过50目筛。由图 1、2可知，补骨脂饮片中P、IP、PO、IPO 4个指标成分的质量随着标准筛目数的改变而变化，补骨脂饮片不同目数标准筛上的粉末中PO、IPO含量随着标准筛目数增加而减少，P、IP的含量随着标准筛目数增加而增加；薄层色谱结果显示P、IP的荧光斑点随着标准筛目数增加而增强，与含量测定趋势一致。

补骨脂饮片由果皮和种子组成，补骨脂果皮主要含有P、IP等脂溶性成分，易粉碎；补骨脂种子主要含有PO、IPO，质地坚硬不易粉碎^[12]。因此，粒度越小的饮片粉末主要为补骨脂果皮粉末（易粉碎），P、IP含量较高；越大的饮片粉末主要为种子粉末（不易粉碎），PO、IPO含量较高，P、IP含量较低。

3.2 补骨脂饮片粉碎工艺正交实验研究

结合“3.1”的结果和《中国药典》补骨脂项下相关规定，采用标准三号药筛（50目）筛取制备补骨脂标准饮片粉末，按“2.3”项下方法制备补骨脂饮片粉末供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定供试品溶液中指标成分的含量。按“2.4”项下方法，以粉碎时间、粉碎次数、投料量（以投料药材占粉碎室的体积计）为因素，以出粉率、化合物含量为指标进行正交实验，优选最佳粉碎工艺，测定结果见表 2。

通过正交实验设计助手对实验数据进行分析，以归一化面积（S）为指标进行评价，考察不同因素对生补骨脂饮片研究结果的归一化面积的影响为：B>A>C，最佳粉碎工艺为A2B3C1，即投料量为1/4粉碎室的体积，单次粉碎时间30 s，粉碎3次，过50目筛，即得；考察不同因素对盐补骨脂饮片研究结果的归一化面积的影响为：B>C>A，最佳粉碎工艺为A2B2C2，即投料量为1/3粉碎室的体积，单次粉碎时间30 s，粉碎2次，过50目筛，即得。测定结果见图 3。

3.3 生补骨脂和盐补骨脂饮片最佳粉碎工艺验证研究

按“2.5”项下方法，采用最佳粉碎工艺制备的生补骨脂饮片的出粉率97.42%，RSD为0.02%（n=3）；PO、IPO、P、IP的总含量为0.127 8 mmol/g，RSD为0.77%（n=3），说明生补骨脂最佳粉碎工艺稳定、可行。采用最佳粉碎工艺制备的盐补骨脂饮片的出粉率97.15%，RSD为0.35%（n=3）；PO、IPO、P、IP的总含量为0.130 6 mmol/g，RSD为1.71%（n=3），说明盐补骨脂最佳粉碎工艺稳定、可行。

4 结论

本实验借鉴蛛网模式的研究方法，通过出粉率、指标成分的总含量计算归一化面积（S），采用正交实验法以S为指标对补骨脂饮片进行粉末均匀化工艺研究，经粉碎工艺放大验证，该方法可行。