再生障碍性贫血（AA）是一种免疫介导的以全血细胞减少为特征的骨髓衰竭性疾病。重型再生障碍性贫血（SAA）属于AA中较为严重的一型，其血细胞重度减少，发展迅速，预后不佳。免疫抑制治疗（IST）是目前SAA的一线治疗之一，应用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）联合环抱素A（CsA）治疗SAA反应率为60%~80%^[1]，患者获得IST反应的中位时间多数在治疗后的2~3个月，20%的患者则在3~6个月后出现^[2]。IST的运用使SAA病死率从95%下降到10%~20%^[3]，但仍有相当一部分患者由于骨髓造血早期未能恢复，造成感染、出血风险增加，乃至死亡^[4]。SAA为临床常见的难治性血液系统疾病，中西医结合治疗该病的效果已得到认可，如何在IST中联合中医药进行有效干预以提高SAA疗效值得重视。本研究采用随机双盲对照试验，验证免疫抑制剂联合“补肾健脾活血”法治疗SAA疗效的可靠性，观察其对T淋巴细胞亚群的影响，探讨其在SAA早期造血恢复中的作用机制。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选择2016年1月—2017年12月在上海中医药大学附属曙光医院血液科就诊的SAA患者60例。采用中央随机系统进行随机化过程，通过网络申请得到随机号，随机化程序设计采用SAS 9.3进行，将入组患者分为治疗组和对照组各30例。治疗组男16例，女14例；年龄15~70岁，平均（44.88±13.74）岁；病程最短1个月，最长5年，平均（0.92±0.78）年。对照组男13例，女17例；年龄16~73岁，平均（42.57±16.32）岁；病程最短3个月，最长6年，平均（0.89±0.71）年。两组患者性别、年龄、病程、血象、骨髓象方面比较差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准（2015-KL-002-02）。

1.2 诊断与纳入标准

符合《血液病诊断及疗效标准》SAA诊断标准^[5]，疾病处于造血恢复早期阶段抗胸腺细胞球蛋白（ATG）联合CsA治疗1个月内，并签署知情同意书。

1.3 排除标准

1）排除其他引起全血细胞减少的疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症、骨髓增生异常综合征、急性造血功能停滞、骨髓纤维化等。2）排除先天性AA患者。3）SAA考虑进行造血干细胞移植治疗的AA患者。4）合并严重心、脑、肝、肾疾病及精神病患者，ECOG评分 > 2分。5）妊娠、哺乳期妇女。6）无法服用中药或对中药过敏的患者。

1.4 治疗方法

两组均予IST。兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（Genzyme Polyclonals S.A.S生产；批号：T03D-2）2.5 mg/（kg·d），加入生理盐水250 mL中静脉滴注4~6 h，连用5 d。环孢素软胶囊（杭州中美华东制药有限公司；批号：120932），口服剂量5 mg/（kg·d），每日2次，定期监测患者血药浓度，使环孢素浓度维持在150~250 ng/mL。

两组均予支持治疗：如血红蛋白 < 60g/L，予红细胞悬液输注；如血小板计数 < 5.0×10⁹/L（无出血危险因子）或 < 20.0×10⁹/L（有明显出血倾向或存在出血危险因子），予血小板悬液输注及对症止血治疗。如合并感染，根据感染部位及严重程度及时给予有效抗感染治疗。

治疗组在西医综合治疗方案基础上联合运用中药补肾健脾活血方，药物组成：熟地黄20 g，山茱萸20 g，淮山药20 g，牡丹皮15 g，茯苓20 g，鹿角胶（烊化）12 g，仙茅10 g，仙灵脾10 g，炙黄芪30 g，党参20 g，白术20 g，生龙骨30 g，生牡蛎30 g，赤芍15 g，当归12 g，生地10 g，益母草15 g，茜草10 g，生甘草10 g，每日1剂，水煎服，早晚各1次。对照组在西医综合治疗方案基础上予1/10治疗中药量联合模拟剂治疗，每日1剂，水煎服，早晚各1次。两组均连续治疗3个月。

1.5 观察指标 1.5.1 外周血细胞计数

每2周用COULTER LH750全自动血细胞分析仪检测1次。

1.5.2 T淋巴细胞亚群

患者分别于治疗前后使用BECKMAN-COULTER公司的Cytomics FC 500流式细胞仪检测CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺CD25⁺T细胞亚群各1次。所用单克隆抗体CD3^-PerCp、CD4^-FITC、CD8^-PE、CD25^-APC、叉状头/翅膀状螺旋转录因子（Foxp3）^-PE及其同型阴性对照抗体均购自BECKMAN公司，破膜/固定剂购自eBioscience公司，佛波酯、离子霉素购自Sigma公司。用Cytomics FC 500自带软件分析数据。

1.6 疗效标准

考虑研究成果与国际接轨和临床操作的方便性，疗效评价标准参考英国血液学会AA诊治指南中AA免疫抑制疗效标准，分为完全有效、部分有效、无效^[6]。其中完全有效必须同时满足以下4项：1）血红蛋白≥120 g/L（男性），≥110 g/L（女性）。2）中性粒细胞≥1.5×10⁹/L。3）血小板≥100×10⁹/L。4）脱离输血。部分有效同时满足以下2项：1）脱离输血。2）不符合SAA诊断标准。无效：仍完全符合SAA诊断标准。疗效判定需至少参考连续2次以上的外周血象（每次间隔 > 4周），期间也未曾接受成分输血或细胞因子治疗。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，计数资料用频数表示。计量资料满足正态分布且方差齐性，同组治疗前后比较采用配对t检验，组间比较采用成组t检验。等级资料组间比较采用秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 两组临床疗效比较

治疗组完全有效8例，部分有效17，无效5例；对照组完全有效5例，部分有效16例，无效9例。治疗组、对照组临床总有效率分别为83.33%、70.00%，两组总有效率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

2.2 两组治疗前后外周血细胞计数比较

治疗前两组外周血细胞计数比较差异无统计学意义（P > 0.05），治疗组治疗后白细胞、红细胞、血红蛋白计数、血小板计数明显上升，与治疗前相比差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。对照组治疗后红细胞、血红蛋白计数及血小板计数上升，与治疗前相比差异有统计学意义（P < 0.05）。治疗后治疗组血红蛋白计数高于对照组（P < 0.05）。见表 2。

2.3 两组治疗前后T淋巴细胞亚群比例分析

治疗组治疗后CD3⁺CD4^-CD8⁺细胞比例降低，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺CD25⁺细胞比例升高，与治疗前相比差异有统计学意义（P < 0.05）。且CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺CD25⁺细胞比例与对照组治疗后比较差异有统计学意义（P < 0.05）。对照组各项治疗前后差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。

3 讨论

SAA是免疫介导的造血功能衰竭综合征，临床上表现为严重的感染、出血和贫血，属于中医“虚劳”“髓劳”等范畴。《素问·通评虚实论》云：“精气夺则虚。”历代医家对虚劳多有论著^[7]，本科已故吴翰香老先生提出，SAA所属“虚劳”并非广义虚劳，而是《医门法律》中所载的虚劳，其指髓不生血，营血不荣于五脏六腑，继而时邪外袭，火热迸入，“营血为卫气所迫，不能内守而脱出于外”，见诸血证。髓不生血（贫血）是虚劳的病之根本，火热迸入和营不内守（感染和出血）为因虚致病，是病之变端，这和现代SAA的临床表现极为相似^[8]。

虚劳的发生涉及五脏，但最基本病机在于脾肾。诚如《类证治裁》中曰：“凡虚损多起于脾肾，劳瘵多起于肾。”肾为先天之本，藏精主骨生髓，为阴阳之根，而脾为后天之本，气血生化之根本，主运化统血。“精血互生”“气血同源”，肾虚则精气亏虚无以生髓化血，脾虚则气血生化无源。《素问·生气通天论》云：“骨髓坚固，气血皆从。”体现骨髓与气血的紧密关系，肾中精气充盈依赖于脾胃化生精微的荣养，脾肾俱虚终会导致气血阴阳的失调。西医学证实SAA病理基础为骨髓造血功能衰竭，这与肾藏精生髓，以及髓血同源的中医理论相契合。在虚损表现的同时，SAA患者往往合并有感染、出血，然此两者实为标实，病之根本仍在脾肾亏虚。因气虚血亏以致卫外不固，易感外邪，正邪相争，引起感染发热；或精亏气虚以致阴火内生，阴阳不相为守，迫血外行，见之于出血，因虚致病，故补肾健脾确为中医治则的关键。

SAA患者除虚劳、发热、血证表现之外，亦常会出现瘀血内阻之候，如皮下瘀点瘀斑、肌肤甲错、舌紫黯、脉涩等。究其原因，其一是虚劳和血瘀两者有着“因虚致瘀、因瘀致虚”的相互关系，《金匮要略》指出：“五劳虚极赢瘦，腹满不能饮食……经络营卫气伤，内有干血，肌肤甲错，两目黯黑，缓中补虚，大黄蛰虫丸主之。”为活血化瘀法治疗贫血提供了理论依据；其二是因邪致瘀，反复出血及热迫血行造成的离经之血，使得血不归经，形成瘀血。所谓“瘀血不去，新血不生”，瘀血内停致髓海瘀阻，影响造血功能。同时，瘀血不仅是AA病程中脾肾亏虚造成的病理产物，它的存在亦可加重出血感染，变生诸证，缠绵难愈，故应在补肾健脾治则的基础上兼用活血祛瘀法，两者相辅相成^[9-10]。现代研究也发现，SAA有骨髓微血管破坏、血管新生减少和基质细胞缺陷的病理改变，造成骨髓脂肪化加速、细胞因子分泌紊乱、抑制造血功能^[11-12]。实验证明活血祛瘀药恰能改善骨髓微环境、调节机体免疫功能、促进正常造血细胞增殖分化，是治疗贫血的有效方法^[13-14]。

本研究补肾健脾活血方中，运用六味地黄丸合四君子汤加减，熟地黄补血滋阴、益髓填精，与山茱萸、山药形成三阴并补，牡丹皮、茯苓防滋腻太过，同时根据阴阳互根，孤阴不生、孤阳不长之理论，予鹿角胶、仙茅、仙灵脾温补肾阳，共治肾虚髓枯之证。“一切补气之方，皆出于四君”，方中党参、白术、茯苓、甘草共奏益气健脾之功，以资气血生化之源，加用炙黄芪补气升阳，与养血和营之当归合用，使阳生阴长，气旺血生。SAA患者临床常见出血，方中生龙骨、生牡蛎、山茱萸出自补络补管汤（《医学衷中参西录》方），取其收敛止血之意。赤芍、茜草、益母草活血化瘀，以达“以通为用”的目的，与止血药相伍，一收一散，止血不留瘀，活血不肆溢。诸药合用，补肾健脾，使先天后天相互为用，兼用活血化瘀药，以奏祛瘀生新、瘀除邪退之功。

目前ATG联合CsA是IST的标准方案，治疗6个月时大约有70% SAA患者有血液学反应^[15]。本研究结果显示，免疫抑制剂联合中医“补肾健脾活血”法治疗SAA可有效改善患者外周血象，使白细胞、血小板均有提升，尤其对红细胞、血红蛋白有显著提高作用，且总有效率优于照组相。

大量研究表明，AA造血功能衰竭与免疫机制异常相关，T淋巴细胞亚群比例失调，CD4⁺T细胞减少，而CD8⁺T细胞增加，异常活化CD8⁺T细胞可通过细胞毒作用直接抑制骨髓造血干细胞增殖，同时也可以通过释放大量造血负向调控因子如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等诱导造血干细胞凋亡从而抑制骨髓造血^[16-17]。本研究结果显示，治疗组治疗后，CD3⁺CD4^-CD8⁺细胞比例降低，CD3⁺CD4⁺CD8^-细胞比例及CD4⁺/CD8⁺比值均上升。由此提示“补肾健脾活血”法可能通过抑制CD8⁺T细胞过度活化，调节T淋巴细胞亚群比例，促进SAA患者早期骨髓造血的恢复。

研究发现，AA患者与正常人相比较，存在调节性T细胞（Treg）比例及绝对值数降低，并与疾病的严重程度呈正相关^[18-19]。所以，Treg细胞数量减少、功能低下，进而导致效应T细胞的异常增殖活化，在AA发病中有重要作用。Foxp3是Treg细胞产生功能的关键性调节基因，特异性表达于Treg细胞，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞的存在抑制了效应T细胞的活化，而其减少会使人体免疫调节机制发生异常进而导致AA的发生^[20-21]。本研究结果示，治疗组治疗后CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺较治疗前升高（^P < 0.05），且与对照组相比增高明显（^P < 0.05），提示“补肾健脾活血”法可以通过提高Foxp3的表达，从而增强Treg的免疫功能，维持机体免疫平衡，恢复骨髓造血。