糖尿病足是糖尿病患者的一种严重的并发症，其发病率高达25%^[1]。糖尿病足溃疡好发于足趾，烧/烫伤是最常见诱因^[2]，其中以低温烫伤（40~44 ℃）出现的机率更大^[3]。由于糖尿病足患者普遍存在神经病变，温觉及痛觉等感觉功能减退、甚至丧失，不能及时感受到外源性高温，易致烫伤。同时，病变的血管仅可维持皮肤组织的生存，无法对创伤和感染等做出自我保护，故对感染难控的糖尿病患者^[4]而言，酷似患有创伤愈合衰竭症^[5]。

在临床中已有报道应用京万红软膏治疗糖尿病足效果良好^[6-7]，糖尿病足和京万红软膏主治的烧烫伤均具有脉络瘀阻、血行不畅、电解质紊乱、机体免疫力下降等共性^[8]，京万红软膏具有活血消肿、祛瘀止痛、解毒排脓、祛腐生肌的功效，将其运用于大鼠糖尿病足烫伤的治疗，评价其药效并探究其作用机制，望为临床上糖尿病足烫伤的治疗提供实验依据。

1 实验材料 1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠60只：天津市山川红实验动物科技有限公司提供，体质量200~220 g。

1.2 实验药物及试剂

1）京万红软膏（20 g，天津达仁堂京万红药业有限公司，批号：211692）。2）重组人表皮生长因子外用溶液（rhEGF，2 000 U×15 mL，深圳市华生元素基因工程发展有限公司）。3）链尿佐菌素（STZ，sigma公司，S0310）。4）超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。5）Trnzol总RNA提取试剂盒，RNase Free Water（RT 121-01）、溴化乙锭（EB，RT 203）、Quant cDNA第一链合成试剂盒、FastSYBR Mixture（With ROX）试剂盒（北京康为世纪有限公司）。6）DNA Ladder Maker（宝生物工程大连有限公司，D526A）。7）聚合酶链反应（PCR）反应引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。

1.3 实验仪器

美国强生稳豪型血糖仪，HH-S8数显恒温水浴锅（金坛市盛蓝仪器制造有限公司），足趾测量仪（上海软隆科技发展有限公司，BW-YLS-7B），电动匀浆机，DU-530紫外分光光度计（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美国），7 500 Fast实时荧光定量PCR仪（Life Technologies，Foster City，CA，USA），三恒电泳仪（EPC3000），多功能读板机（Flex Station 3型，Molecular Devieces），凝胶成像分析仪（Cuene Genins），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

2 实验方法 2.1 糖尿病及糖尿病足模型的复制

选用Wistar大鼠60只，雄性，体质量200~220 g。大鼠禁食后，据空腹体质量以50 mg/kg的剂量腹腔快速注以无菌的柠檬酸缓冲液（pH 4.35）配制而成的1%浓度（质量分数）的STZ溶液。1周后空腹血糖值大于16.65 mmol/L的大鼠视为糖尿病模型复制成功。

血糖达标的大鼠喂养1个月后，复制大鼠糖尿病足烫伤模型。选用Wistar大鼠45只，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，调节水浴锅温度为（60±1）℃，将大鼠左后足踝关节上方0.5 cm处做标记，将其以下部分浸入热水中，保持固定不动，20 s后取出。2 h后大鼠左后足出现明显红肿、大水泡，表示深Ⅱ度烫伤模型复制成功[对深Ⅱ度烫伤的定义为：已伤及真皮层，伤口愈合之后会留下疤痕，大且厚层的水泡盖住广泛的区域，相当于瓦格钠（Wagner）分级的3级]^[9]。

2.2 分组及给药方法

造模后，按照大鼠体质量、血糖及造模后瓦格纳分级结果将45只大鼠平行分为3组：模型组、京万红软膏组、rhEGF组，每组15只；另外15只大鼠作为假手术组进行对照。造模后当天按照体质量开始给药，假手术组、模型组均给予空白基质（3 g/kg），京万红软膏组给予京万红软膏（3 g/kg），rhEGF组给予rhEGF（4 000 U/10×10 cm²），以无菌纱布包扎，每日1次，连续换药14 d。

2.3 足趾体积

在大鼠左后足踩关节上方0.5 cm处做标记，分别于给药前、1、3、5 d后用足趾测量仪测量其体积，每只大鼠测量两次，取平均值。

2.4 Wagner分级

记录各组大鼠给药前、5、10、14 d后Wagner分级结果。级数代表了足部溃疡的程度，级数越小，足部损伤程度越小，越接近正常的组织。

Wagner分级标准如下^[10]：0级：皮肤完整；l级：表浅溃疡；2级：深部溃疡（影响软组织）；3级：肌腱韧带受损、深部脓肿；4级：严重感染、骨质破坏、缺损、骨髓炎；5级：湿性或干性坏死、一般需截肢。

2.5 足部宏观形态

分别于给药前、给药1、3、5、7、10、14 d后对各组大鼠足部进行观察并记录图像。

2.6 SOD、MDA与一氧化氮（NO）的含量

给药14 d后，处死大鼠，将左后足踝关节上方0.5 cm标记处以下的足部组织用8%的硫化钠脱毛擦干取下，小心剔除骨头，保留全部的皮肤组织制成10%组织匀浆备用。用酶标仪测定SOD、MDA、NO的含量。

2.7 大鼠足部组织中血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子-β（TGF-β）mRNA的表达情况

采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测，首先提取RNA，提取总RNA用核酸蛋白分析仪260 nm测定OD值，计算其RNA含量。将mRNA反转录为cDNA，后对cDNA进行扩增。以GAPDH为内参，计算PDGF、TGF-β mRNA的相对表达水平。PCR引物信息见表 1。

2.8 数据采集

PT-PCR具体步骤参考FastSYBR Mixture（With ROX）试剂盒的说明，导出所有孔的CT值，根据2（^-ΔΔCT）计算每个基因表达水平的倍数变化。

2.9 统计学方法

实验数据利用统计软件SPSS 23.0进行统计分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P < 0.05表示差异有显著性。

3 实验结果 3.1 足趾体积

给药5 d后，模型组大鼠的足部多数不再完整，出现不同程度的断足，故统计至第5天。给药前，各给药组的足趾体积与模型组间没有统计学差异，足部皮肤均出现明显的肿胀，大而厚的水泡覆盖了整个足部。见表 2。

与模型组相较，给药1 d后，京万红软膏组可极显著的减小足趾体积（P < 0.01），给药3 d和5 d后，京万红软膏组可显著减小糖尿病大鼠的足趾体积（P < 0.05），说明京万红软膏可明显减轻组织充血和水肿，对创面组织具有较好的消肿作用。

3.2 Wagner分级

给药前，各组大鼠足部损伤程度一致，足部均呈现大且厚层的水泡，全层皮层溃疡，并侵犯深部组织，为Wagner分级的3级。给药5 d后，与模型组相比，各给药组分级结果差异无显著性。给药10 d后，模型组足部多为蜂窝组织与大脓腔，而各给药组新生表皮修复迅速，具有明显的好转，与模型组相较，差异具有显著性（P < 0.01）。给药14 d后，模型组多数大鼠足部均出现肢端坏死，甚至断肢。而各给药组表皮完整，病灶修复良好，与模型组相较，差异具有显著性（P < 0.01）。见表 3。

3.3 宏观形态

造模后各组大鼠足部形态无明显差异，均呈现出大而厚的水泡。随着给药天数的增多，模型组溃疡程度逐天加重，且水泡逐渐转变成大脓腔，坏死组织增多，最后甚至出现断肢。而京万红软膏组、rhEGF组给药后，肿胀体积逐日减小，对感染的控制、溃疡及坏死组织的修复良好。见图 1、2。

3.4 SOD、MDA、NO的测定

与模型组相比，京万红软膏组、rhEGF组可显著升高SOD的含量（P < 0.05），而对MDA和NO的含量无显著性影响。见表 4。

3.5 京万红软膏对PDGF、TGF-β mRNA表达的影响

与模型组相比，京万红软膏组可显著的升高PDGF mRNA的表达（P < 0.05），rhEGF组可显著升高TGF-β mRNA的表达（P < 0.05）。见图 3。

4 讨论

京万红软膏是由地榆、当归、黄连、黄柏、红花等30余种中药组方而成的纯中药制剂，在烧烫伤、皮肤创伤、术后切口感染、带状疱疹、褥疮等皮肤损伤中均有不同程度的疗效^[11]，在临床中可单独或联合运用于糖尿病足的有效治疗^[12]，研究将京万红软膏作用于大鼠糖尿病足烫伤模型，并探究其机制。

SOD是生物体内清除超氧阴离子自由基的重要抗氧化酶，可有效地清除过量的氧自由基^[13]，是参与氧化应激的重要指标。氧化应激的产生是由于自由基的剧增与体内抗氧化最大清除限度的失衡。当机体处于高糖状态时，氧化产物蓄积，过多的自由基可使抗氧化成分SOD发生过氧化，使之灭活并骤减，诱导氧化应激，从而导致组织与细胞损伤，糖尿病足创面难以愈合。可见，提升糖尿病足创面处SOD的含量是促进其愈合的关键指标。实验结果表明，京万红软膏组可显著升高糖尿病大鼠烫伤足部的SOD含量，提示了京万红软膏组能促进大鼠足部烫伤后溃疡的愈合、减轻氧化应激和炎症反应、起到改善病情的作用很可能与清除过量的氧自由基相关。

TGF-β可趋化成纤维细胞、表皮细胞和血管内皮细胞的迁徙与增殖，此外，在新生肉芽组织、胶原的形成过程中起关键性作用^[14]。本研究中，rhEGF组可显著升高TGF-βmRNA的表达（P < 0.05），可见rhEGF组创面修复等生物学效应的发挥可能与上调TGF-β mRNA的表达相关。

糖尿病足患者多有血管、神经病变，足部创面常伴随氧化应激、糖基化终末产物、炎性因子等微环境异常，这些因素不但使创面迁延不愈，同时也引起PDGF等与创面愈合密切相关的生长因子的含量及生物活性的下降^[15]。PDGF可与靶细胞膜上的受体相结合，产生各种重要生物学效应。对于平滑肌、内皮等细胞，具有调控靶细胞增殖、迁移和分化的作用；对炎性细胞、中性粒细粒、巨噬细胞等具有趋化作用，此外，可诱导磷脂酞肌醇和花生四烯酸的释放，参与前列腺素、细胞外基质的合成，促进肉芽组织的生长^[16]。实验结果表明，京万红软膏组具有促进PDGF mRNA表达上调的趋势（P < 0.05），可见在糖尿病大鼠烫伤的足部组织中，伤口的愈合作用很可能与PDGF mRNA的生物学效应的发挥相关。

京万红软膏针对大鼠糖尿病足烫伤，通过促进表皮消肿、控制感染、祛除坏死组织等达到创面修复目的，可显著升高溃疡组织中SOD的含量和PDGF mRNA的表达，提示京万红软膏对糖尿病足的愈合作用可能与消除过量的氧自由基，调控与创面愈合及组织修复具有重要作用的修复生长因子血小板源性生长因子PDGF相关，值得在临床上应用及进一步研究。