2020年初新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎）的突发给中国人民健康和经济发展带来了巨大打击。该疫情被世界卫生组织列为国际关注的公共突发卫生事件。短短两个月事件造成全国7万余人感染，3 000余人死亡，疫情波及30个国家，引起了世界范围的恐慌。

近年世界范围多次出现病毒性呼吸道传播疾病，包括2003年严重急性呼吸综合征（SARS）、2009年H7N9流感、2012年中东呼吸综合征（MERS）等相关疫情。疾病发生频率逐渐加快，病毒变异迅速，从常规抗病毒化学药物、疫苗研发规律来看，临床有效治疗药物缺乏，治疗手段难以及时跟进。如何发挥中医药防疫抗病能力成为中医药研究者的重要课题。

在新型冠状病毒感染后，体液中迅速大量产生多种细胞因子，形成细胞因子风暴，导致人体免疫系统紊乱，引起急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭等症^[1]。细胞因子风暴需药物及时干预，以避免过多的组织液肺部渗出，影响呼吸功能^[2]。大量临床证据证实，病毒侵染呼吸系统，造成肺损伤后可引起肺纤维化。SARS流行期间，有45%的患者在感染后1个月肺部表现出“毛玻璃”外观。跟踪病例研究显示，有27.8%的SARS幸存者肺功能下降，肺纤维化程度增加。肺纤维化是病毒性肺炎患者恢复期的常见后遗症，缺乏有效临床治疗药物。

本研究收集了多种上市中成药，筛选抗成纤维细胞胶原沉积活性药物，为病毒感染肺损伤者的愈后干预提供科学依据。

1 实验部分 1.1 仪器与材料

KO-250E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；IKA RV 10旋转蒸发仪，德国IKA公司；Milli-Q超纯水制备仪，Millpore公司；超声裂解仪，宁波新芝生物科技有限公司；DC300F倒置相差显微镜，德国Leica公司；多功能酶标仪，Tecan公司；倒置显微镜，日本Nikon公司；NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞株及MRC5人源成纤维细胞株均来自ATCC；转化生长因子-β1（TGF-β1），R&D system公司；SB431542，美国Selleck公司；DMEM培养基、胎牛血清均购于美国Gibco公司；1%青/链霉素，美国HyClone公司；乙醇、二甲基亚砜（DMSO）等化学试剂均为分析纯，天津康科德科技有限公司。

1.2 中成药提取

收集多种上市中成药，粉碎后（喷雾剂使用原料）以10倍70%乙醇溶液（W/V）超声提取30 min，4 000 g离心10 min，离心半径为150 mm，吸取上清液，40 ℃减压浓缩至干，干燥粉末以100 mg/mL浓度溶于DMSO中，备用。

1.3 成纤维细胞胶原含量检测

参考文献方法^[3]，收集对数生长期细胞，以1×10⁵/mL将鼠源胚胎成纤维NIH-3T3细胞，人源肺成纤维化MRC5细胞接种到96孔板中，以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基在37 ℃，5% CO₂环境下培养，过夜后更换为无血清培养基。同步化24 h后，用TGF-β1（5 ng/mL）处理48 h为模型组，用TGF-β1+SB431542（TGF-β1抑制剂，终浓度5 μmol/L）作为阳性药组，TGF-β1+ 100 μg/mL（终浓度，DMSO浓度为0.1%）不同中成药提取物为给药组，空白对照组直接加培养基100 μL培养。48 h后弃去孔中培养基，并用200 μL PBS洗涤细胞3次，用-20 ℃冰甲醇固定过夜后，200 μL PBS洗涤3次，每孔加入100 μL天狼星红试剂，室温避光放置4 h，弃去游离的天狼星红，每孔用200 μL的0.01%乙酸洗涤3次后风干，加入200 μL 0.1 mol/L NaOH，振荡1 h后应用多功能酶标仪在540 nm处进行吸光度的测定。相对胶原沉积率= A_{540 nm}（给药组）/A_{540 nm}（阳性药组）。包括模型组、阳性药组、空白对照组、给药组在内的每组样品都平行进行了4次复孔实验。

1.4 统计学方法

使用SPSS 20.0统计软件，实验数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用Dunnett检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果 2.1 成纤维细胞胶原沉积模型构建及中药提取物对细胞活力的影响

肺成纤维细胞贴壁同步化后，通过TGF-β1诱导48 h，经天狼星红染色，镜下可见明显胶原沉积。阳性对照药，TGF-β1抑制剂SB431542（SB，终浓度5 μmol/L）可有效降低胶原沉积（人源肺成纤维细胞胶原沉积模型，见图 1；鼠源胚胎纤维细胞胶原沉积模型，见图 2），说明本实验体系建立成功。各中成药提取物在本实验设计浓度下，镜下未见细胞形态及密度明显改变。

2.2 中成药提取物对MRC5人源肺成纤维细胞胶原沉积的影响

与空白对照组相比，TGF-β1诱导人源肺成纤维细胞胶原沉积量上升约1.3倍，TGF-β1抑制剂SB431542（终浓度5 μmol/L）处理后能有效降低胶原沉积至正常水平。在100 μg/ mL浓度下，清喉利咽颗粒、止嗽定喘丸、清金止嗽化痰丸（天津中新药业乐仁堂制药厂，生产批号分别为0780974、15502235和0790104），六神丸（上海雷允上药业有限公司，生产批号为190601），复方一枝黄花喷雾剂（贵州百灵企业集团，生产批号为20200115），复方芩兰口服液（黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，生产批号为B36200206001），八宝丹胶囊（厦门中药厂，生产批号为190630），痰热清胶囊（上海凯宝药业股份有限公司，生产批号为2001102），蒲地蓝消炎片、通宣理肺片、清瘟解毒片（天津中新药业隆顺榕制药厂，生产批号分别为190082、250001和220002）等11种中成药提取物能有效抑制胶原沉积（见表 1，图 3）。

2.3 中成药提取物对NIH/3T3鼠源胚胎成纤维细胞胶原沉积的影响

与空白对照组相比，TGF-β1诱导鼠源胚胎成纤维细胞胶原沉积量上升约1.2倍，TGF-β1抑制剂SB431542（终浓度5 μmol/L）处理后能有效降低胶原沉积至正常水平。在100 μg/mL浓度下，牛黄清心丸局方（天津中新药业达仁堂制药厂，生产批号190622），清喉利咽颗粒、止嗽定喘丸（天津中新药业乐仁堂制药厂，生产批号分别为0780974和15502235），八宝丹胶囊（厦门中药厂，生产批号为190630），痰热清胶囊（上海凯宝药业股份有限公司，生产批号为2001102），清热解毒口服液、清开灵注射液（神威药业集团，生产批号分别为1912271和20011601），清瘟解毒片（天津中新药业隆顺榕制药厂，生产批号为220002）等8种中成药提取物能有效抑制胶原沉积（表 2，图 4）。

3 讨论

在肺部炎症的损伤修复阶段，巨噬细胞调节炎症反应，并分泌转化生长因子TGF-β1和血小板衍生生长因子等，刺激成纤维细胞增殖，造成胞外基质重塑，胶原蛋白过度沉积，这个过程如果不加以药物干预，将发展为不可逆的肺纤维化，肺部会出现“毛玻璃”“蜂窝煤”状，导致呼吸困难甚至衰竭，严重影响患者生活质量。

目前，美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗肺纤维化的药物仅有吡非尼酮（细胞因子抑制剂）和尼达尼布（酪氨酸激酶抑制剂）^[4]，但这两种药物临床用量大，治疗成本高，且易出现耐药性，患者依从性差。目前为止，中国尚无治疗肺纤维化药物上市。中医认为，肺纤维化属于“肺痹”和“肺痿”的范畴，其病机在于气阴两虚，并兼有痰、瘀、热之邪。气滞而痰凝，脾虚而聚湿，阻于肺腔。中医治疗以益气养阴为主，活血化瘀为辅，补肺生津，标本兼治。临床证实，血府逐瘀汤、丹参饮合二陈汤、桑白皮汤^[5]等具有一定临床治疗效果。

本研究从已上市中成药出发，寻找能有效抑制胶原沉积、阻碍肺纤维化发生发展的药物，以满足肺纤维化治疗的临床药物需求。在对纤维化考察的细胞水平实验中，人源肺成纤维细胞（MRC-5）和鼠源胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）为体外实验常用的两种细胞系^[6-7]。在纤维化的发展过程中，一部分纤维细胞分化为肌成纤维细胞，产生并积聚过量的胶原蛋白，胶原蛋白沉积会破坏肺部组织结构和功能，引发纤维化^[8-9]。本实验所涉及的两种细胞模型，均首先通过TGF-β诱导活化后用天狼星红染色法检测细胞内胶原沉积，确定模型诱导成功，以此作为肺纤维化中胶原沉积的细胞模型。研究结果表明，清喉利咽颗粒、止嗽定喘丸、八宝丹胶囊、痰热清胶囊、清瘟解毒片5种中成药提取物，对鼠源、人源肺成纤维化细胞的胶原沉积均有抑制作用，提示这些上市中成药有应用于治疗肺纤维化的前景。

进一步对所有有效中成药组成药味进行分析，结果发现，黄芩、甘草、连翘、桔梗等饮片使用频率较高，通过文献查阅，对这4味药所含有的化学成分进行了整理，与本研究发现一致，如黄芩中的黄芩苷、黄芩素，甘草中的甘草酸^[8]、甘草次酸，连翘中的连翘苷元、牛蒡子苷，桔梗根中的皂苷类成分等对纤维化有缓解作用^[10-17]。

本研究正在持续进行，下一步将针对活性中成药开展体内研究，以明确其药效物质及作用机制，为临床治疗肺纤维化提供科学依据。

致谢：多家中药制药企业无私提供检测样品，在此表示衷心地感谢!由于时间仓促，本次仅报道了部分结果，后续研究将陆续报道，为疫情防控提供中医科技支撑。