葶苈子始载于《神农本草经》，味辛、苦，性寒，主癥瘕积聚结气、饮食寒热、破坚逐邪、通利水道^[1]。传统认为有甜、苦两种，2015版《中华人民共和国药典》规定其药用来源为十字花科植物播娘蒿Desurainia sophia（L.）Webb. ex Prantl（又称南葶苈子）和独行菜Lepidium apetalum Willd.（又称北葶苈子）的干燥成熟种子，前者称为甜葶苈，后者称为苦葶苈^[2]。葶苈子的炮制方法以清炒炮制为主，最早见于张仲景《金匮要略》葶苈大枣泻肺汤中“葶苈熬令黄”^[3]，关于其炮制作用，清代唐宗海认为“不炒则不香，不能散，故必炒用”^[4]，目前临床认为“炒后药性缓和，免伤肺气”^[5]。

南葶苈子中主要含有异硫氰酸及其硫苷、黄酮、脂肪油类成分，以及强心苷、三萜、甾醇、香豆素、生物碱、酚酸、挥发油、氨基酸等成分，对心血管、高血脂等疾病具有显著功效，所含的成分具有降压、抗癌、细胞毒、抗氧化等药理活性^[6]。目前已有南葶苈子指纹图谱方面的研究报道^[7-8]，对其生品和清炒品的指标性成分检测多以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷和芥子碱硫氰酸盐含量测定为主^[9-12]，尚未见南葶苈子清炒品的指纹图谱研究。因南葶苈子临床传统用药以清炒品为主，因此本研究以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷和芥子碱硫氰酸盐为对照，分别建立南葶苈子生品和其清炒品的HPLC指纹图谱，通过相似度评价和对比研究，探讨南葶苈子清炒前后指纹图谱的变化，为实现南葶苈子清炒品生产过程质量控制、质量信息可追溯提供指纹图谱参考。

1 材料 1.1 仪器

Agilent 1260 InfinityⅡ型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；KQ-500V型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（嘉兴市中新医疗仪器有限公司）；OSB-2100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；HX-200型高速中药粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；ME204万分之一电子天平（梅特勒·托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试剂和药品

甲醇为色谱纯（批号151282，规格4 L，纯度≥99.9%），乙腈为色谱纯（批号156275，规格4 L，纯度≥99.9%），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；磷酸二氢钠分析纯（批号20180225，规格500 g，纯度≥99.5%），北京化工厂。南葶苈子样品采自河南郑州、安徽亳州、河北安国等地（S1~S12），计12个样本，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为十字花科（Cruciferae）植物播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl的干燥成熟种子，见表 1。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷（批号PS14012301，规格20 mg，纯度≥98.0%），芥子碱硫氰酸盐（批号PS14031803，规格20 mg，纯度≥98.0%），成都普思生物科技股份有限公司。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱NUCLEODUR C₁₈色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.01 mol/L NaH₂PO₄水溶液，梯度洗脱：0~6 min，1%~6% CH₃CN；6~24 min，6%~15% CH₃CN；24~32 min，15%~20% CH₃CN；32~47 min，20%~28% CH₃CN；47~52 min，28%~40% CH₃CN；52~54 min，40%~40% CH₃CN。流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量5 μL，色谱分析时间54 min。

2.2 样品制备 2.2.1 南葶苈子生品制备

取各批次南葶苈子药材，去除杂质，筛去灰屑，备用（S1~S12）^[5]。

2.2.2 南葶苈子清炒品制备

取净南葶苈子（S1~S12），置预热的锅内，用文火加热，炒至微鼓起，爆裂声减弱，并有香气逸出时，取出，放凉，备用（相对应炮制品P1~P12）^[5]。

2.2.3 制备对照品溶液

分别称取槲皮素-3-O-β-D-葡糖糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芥子碱硫氰酸盐1.06、1.62 mg，用60%的甲醇溶解并稀释，槲皮素-3-O-β-D-葡糖糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷浓度为21.2 μg/mL，芥子碱硫氰酸盐浓度为162.0 μg/mL，作为对照品溶液。

2.2.4 制备供试品溶液

分别称取5.0 g南葶苈子生品、清炒品（折合生品质量），粉碎过60目筛，置250 mL具塞平底烧瓶中，加蒸馏水170 mL，超声波400 W，温度70 ℃提取30 min，提取液离心，取上清液，旋转蒸发仪蒸干，用甲醇溶解并转移至称量瓶中，于50 ℃下干燥呈浸膏状，真空干燥，恒质量^[13]。精密称取干燥固体物50.00 mg，用60%甲醇溶解并定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液。

2.3 方法学考察 2.3.1 稳定性实验

取南葶苈子生品或清炒品供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样5 μL，各主要色谱峰的相对保留时间RSD均小于2%，相对峰面积比值的RSD均小于3%，表明样品在24 h内稳定。

2.3.2 精密度实验

取南葶苈子生品或清炒品溶液连续进样6次，每次5 μL，各主要色谱峰的相对保留时间均小于1%，相对峰面积比值的RSD均小于3%，表明仪器的精密度良好。符合指纹图谱的检测要求。

2.3.3 重复性实验

取同批次饮片6份，分别精密称定，按“2.3.2”项下方法分别制备供试品溶液6份，分别进样检测。各主要色谱峰的相对保留时间均小于2%，相对峰面积比值的RSD均小于3%，符合指纹图谱的检测要求，表明方法的重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立 2.3.4.1 参照峰的确定

按“2.1”项下的色谱条件，采集“2.3.1”项下所制备的混合对照品溶液色谱图，峰1为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰（峰标号26），峰2为芥子碱硫氰酸盐峰（峰标号30）。见图 1、2。

2.3.4.2 指纹图谱的采集

按2.1项下的色谱条件，分别采集12批南葶苈子生品、清炒品指纹图谱，标出其相同的共有峰，结果见图 3、4。因芥子碱硫氰酸盐峰相应值强，且分离度好，故以芥子碱硫氰酸盐为参照峰，计算其他共有峰的相对峰面积和保留时间，见表 1、2。

2.3.4.3 共有模式的建立

分别将12批南葶苈子生品、清炒品样品色谱指纹图谱数据，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版），以S1为参照图谱，时间窗宽度为0.1，经多点校正后，中位数法生成对照图谱，生品和清炒品对照指纹图谱见图 4。采用相同方法计算生品和清炒品对照指纹图谱的相似度，见表 3。

2.3.5 相似度评价

分别对南葶苈子、清炒南葶苈子HPLC指纹图谱进行相似度计算，见表 4。相似度结果表明，生品S1、S3、S4、S8、S9、S10、S11、S12样品间相似度良好，大于0.9，且与对照指纹图谱相似度均大于0.922。生品S2、S5、S6、S7样品间相似度良好，大于0.919，但与对照指纹图谱相似度小于0.9，与其他生品相似度在0.638~0.888之间，这表明这4批生品与其他生品存在一定的差异，这可能与其成长环境、干燥和贮藏条件等因素有关。清炒后，P1、P4、P8、P9、P10、P11、P12样品间相似度与对照指纹图谱相似度均大于0.92，相似度相比生品更好；P2、P5、P6、P7与对照指纹图谱相似度大于0.953，与其他样品相似度大于0.894，以上结果说明，南葶苈子生品间差异较大，大致归为两类，样品S2、S5、S6、S7为一类，其余样品为一类。清炒后，样品之间相似度得到显著改善，表明建立南葶苈子标准化生产工艺的必要性，清炒炮制能够从一定程度上缓解南葶苈子药间差异，因部分峰面积增大，造成差异减小。这对南葶苈子质量控制、药效一致性研究具有重要意义。

2.3.6 南葶苈子生品与清炒品HPLC指纹图谱比较

以1号样品S1和清炒后P1指纹图谱为例，对比清炒前后差异，见图 5。生品中峰面积大于0.25%的色谱峰有46个，其中色谱峰8、9、13、14、15、23、25、26、30、35、41为清炒前后共有峰。由图 3可看出，清炒后，0~20 min、42~54 min时间段内色谱峰峰面积减小，共有峰No.9、No.13、No.14、No.41峰面积降低，此段成分多为单糖、寡糖、氨基酸类成分（这些成分在254 nm无响应，同时结合紫外吸收和分子极性确定），结合清炒炮制质量标准要求颜色加深，表明此段成分发生了美拉德反应，从而使得清炒品颜色发生褐变、加深^[14]。20~42 min时间段内色谱峰响应值增大，其中共有峰No.23、No.26、No.30、No.35峰面积相对生品均升高，非共有峰No.25峰面积升高，清炒工艺对南葶苈子化学成分有一定影响。

2.3.7 系统聚类分析

将12批南葶苈子和清炒南葶苈子作为研究对象，以芥子碱硫氰酸盐为参照峰，计算共有峰相对峰面积，以共有峰相对峰面积为变量，用SPSS 24.0统计软件，采用离差平方和法，对炮制前后指纹图谱进行聚类分析，见图 6。结果表明，从图 6（a）可看出当聚合距离为5时，生品葶苈子聚为两类，其中S1、S3、S4、S8、S9、S10、S11、S12聚为第1类，S2、S5、S6、S7聚为第2类，与相似度分析结果一致，表明建立的指纹图谱方法可靠。图 6（b）可看出清炒后南葶苈子聚为两类，除了3号样品由第1类归到第2类外，分类结果与生品一致，该结果表明，尽管炮制后12批清炒品相似度得到较大改善，但样品P2、P5、P6、P7与其他样品仍有差别，该结果为相似度评价结果互为补充。从图 6（c）12批南葶苈子生品和其清炒品的聚类分析图中可看出，当聚合距离为10时，南葶苈子12批次清炒品聚为一类，这表明清炒后的南葶苈子和生品有明显区别，清炒工艺对南葶苈子的质量控制具有显著作用；生品S2、S5、S6、S7聚为一类，其他生品聚类一类，此结果与图 6（c）结果一致，表明生品S2、S5、S6、S7与其他生品有区别。

3 讨论

本研究首次采用HPLC指纹图谱比较南葶苈子生品与其清炒品化学指纹图谱的差异，结合相似度评价、系统聚类分析法，不仅能对南葶苈子生品和清炒品进行快速准确鉴别，并且能够准确发现两者的区别。所采用的色谱条件重复性好，易于控制，结果直观可靠，方法简便易行，快速有效，可为南葶苈子生品和清炒品的质量评价提供依据。

选用水作为提取溶剂，符合南葶苈子临床用药的水煎煮的特点，利用超声提取，避免了南葶苈子水煎煮容易糊锅的现象，提取工艺采用了超声水提取优化工艺^[13]。采用二极管阵列检测器（DAD）采集190~400 nm范围内的响应值，通过供试品溶液3D图谱发现，在254 nm条件下，色谱峰响应值较高，峰形对称，峰数较多，分离度较好，基线较为平稳，最终选择254 nm为检测波长。流动相选择，结合参考文献^[13]，并进一步的考察优化，选择了乙腈-0.01 mol/L NaH₂PO₄水溶液为洗脱流动相，优化洗脱程序，基线平稳，色谱峰分离度较好，出峰时间较为适中。故确定流动相为乙腈-0.01 mol/L NaH₂PO₄水溶液。

目前文献记载南葶苈子的指纹图谱，存在所得图谱共有峰数目少，重复性差等^[8]。本实验优化南葶苈子的高效液相指纹图谱测定条件，建立南葶苈子清炒品的指纹图谱。比较南葶苈子生品、清炒品的指纹图谱发现，清炒后南葶苈子通过共有模式建立、相似度评价以及HPLC指纹图谱比较，表明南葶苈子清炒炮制后的HPLC指纹图谱与生品差异较大，清炒后，0~20 min时间段内色谱峰响应值减小，20~42 min时间段内色谱峰响应值增大，如色谱峰槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰（26）、芥子碱硫氰酸盐峰（30），表明清炒炮制对南葶苈子化学成分的溶出有一定的影响。生品HPLC指纹图谱部分批次间差异较大，与其产地来源、加工、干燥、贮藏养护、包装等因素有关，建议尽快建立和完善南葶苈子产地的道地性，产地加工、干燥工艺、贮藏养护、包装工艺规范化和质量标准化。

对于南葶苈子清炒品和生品的HPLC指纹图谱研究还存在不足之处，下一步应扩大样本量，严格按照GMP要求，在控制其产地加工、干燥、贮藏养护、包装等条件下，建立其标准化HPLC指纹图谱或特征图谱，甚至不同产地的HPLC指纹图谱或特征图谱；运用高效液相-质谱联用、超高效液相-质谱联用技术，对南葶苈子清炒炮制前后化学成分进行指认，结合多级质谱裂解技术，探讨其清炒炮制对其化学成分的影响，阐明其清炒机制。