复发性流产（RSA）是生育障碍的常见病症之一，临床亦称习惯性流产，主要是与相同性伴侣在妊娠20周内连续有超过2次的自然流产的现象^[1]。

RSA是生殖领域的一大难点，越来越受到临床重视及关注。RSA的明确病因包括父母染色体异常（如平衡易位携带者等）、母亲子宫结构异常、内分泌异常、自身免疫异常（如抗磷脂抗体综合征）等，但仍有40%的人群无法明确病因^[2]，并且直接影响临床治疗方法及效果。目前对于复发性流产的研究热点聚焦于免疫排斥及免疫耐受。正常妊娠是一个类似于同种异体移植的复杂生理过程。胎儿携带的父源性白细胞组织相容性抗原（HLA）不被母体免疫系统排斥的关键，在于母胎间的免疫耐受关系。母-胎免疫耐受微环境失调是复发性流产的重要影响因素^[3]。既往的研究认为，Th1/Th2细胞因子的平衡是维持生理性妊娠所必需的，其中Th1细胞诱导细胞免疫反应，与组织损伤相关，可抑制胚胎着床、滋养细胞生长和胚胎的发育，不利于妊娠的维持；Th2细胞介导B淋巴细胞增殖、抗体产生和同种免疫耐受作用^[4]。近年来，辅助性T细胞家族的新成员Th17细胞，与介导免疫耐受的调节性T细胞，两者平衡的相关研究备受关注。Th17细胞可引起母胎界面剧烈的局部炎症，导致母体容受性降低，继而发生流产^[5]。而介导免疫耐受的Treg细胞由于其存在免疫无能及免疫抑制的作用特点，可抑制母体对胎儿的免疫反应，进而维持妊娠^[6]。有越来越多的证据表明，Treg和Th17细胞分别作为调节性和效应性细胞，参与了妊娠的建立与维持^[7-10]。

目前临床对于复发性流产的常规西医治疗是补充孕激素。中医方面，复发性流产的病机主要责之脾肾两虚，气血不足。临床诸家报道多以健脾益肾、益气养血安胎为基本治疗大法^[11-12]。基于此，本研究采用自然流产模型小鼠，观察中药自拟固胎煎对流产小鼠模型胚胎丢失率及Th17/Treg细胞的影响，探讨健脾益肾、益气养血安胎中药固胎煎对复发性流产的治疗机制及作用机制。

1 实验动物与试剂 1.1 动物

SPF级CBA/J雌鼠48只，BALB/C雄鼠4只，DBA/2雄鼠20只，周龄8~10周，体质量（20±2）g。CBA/J雌鼠购于北京华阜康生物科技有限公司[许可证号：SCXK（京）2014-0004]；BALB/C雄鼠、DBA/2雄鼠购于北京维通利华生物科技有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0006]。

1.2 药物

自拟固胎煎组成：桑寄生10 g，菟丝子15 g，覆盆子10 g，苎麻根9 g，白术10 g，茯苓10 g，女贞子15 g，墨旱莲10 g，莲须6 g，中药饮片购于北京中医药大学东方医院。制备：用8倍水浸泡，过夜，先煮沸30 min，倒出药液，再加入8倍水，煮沸20 min，最后再加5倍水，煮沸20 min，合并药液并减压浓缩，最后配制成自拟固胎煎煎剂（含生药1.425 g/mL），置-20 ℃冰箱备用。地屈孕酮溶液：由地屈孕酮片[Abbott Biologicals B.V.（荷兰）；批号：H20130110；规格：10 mg/片] 3片溶于200 mL蒸馏水制成，稀释至1.5×10-4 mg/mL，置-20 ℃冰箱备用。

1.3 试剂及仪器

小鼠淋巴细胞分离液（产品编号为：DKW33-R100），购自达科为生物工程有限公司；Fox P3-APC（17-5773-82）和Foxp3 Staining Buffer Set（00-5523-00），购自eBioscience公司；CD3e -PerCP-Cy5.5（561163），CD4-FITC（553047），CD25-PE（553866），Fox P3-APC（17-5773-82），RORγt-BV421（562894），FcR阻断剂（CD16/32）（553142），含1%FBS的磷酸缓冲盐溶液（PBS）和溶血素（349202），购自BD PMG公司；流式细胞仪（FacsCalibur，美国BD公司）。

2 方法 2.1 造模、分组及给药

将CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠2:1合笼，建立正常妊娠模型（CBA/J×BALB/c组），CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠2:1合笼，建立自然流产模型（CBA/J×DBA/2组）。每天20:00开始合笼，早上8:00检查阴栓，肉眼观察阴道口有无乳白色、固态胶状物，发现明显阴栓者为阳性。检出阴栓的小鼠计为妊娠第0天。正常妊娠组予0.9%生理盐水灌胃；自然流产模型组孕鼠随机分为自然流产组、地屈孕酮组、中药低剂量组（低剂量组）、中药中剂量组（中剂量组）、中药高剂量组（高剂量组），每组8只。自然流产组予0.9%生理盐水灌胃，地屈孕酮组予地屈孕酮溶液灌胃，中药低、中、高剂量组分别给予7.125、14.25、28.5 g/kg自拟固胎煎汤剂灌胃，每组灌胃量均稀释至0.4 mL，连续灌胃2周，每日1次。

2.2 胚胎吸收率的计算

孕14 d断颈处理小鼠，迅速解剖，用镊子撕开子宫，记录被吸收的胚胎数和存活胚胎数。胚胎丢失的判断标准：丢失之胚胎体积明显缩小，胎儿胎盘单位有明显出血或坏死。胚胎丢失率（ELR）的计算方法按下列公式进行：ELR=丢失胚胎数/（丢失胚胎数+存活胚胎数）×100%。

2.3 流式细胞检测脾脏Th17、Treg细胞含量

流式细胞仪检测孕鼠脾脏Th17/CD4⁺、Treg/CD4⁺细胞。研磨脾脏，并用淋巴分离液分离脾脏细胞，在试管中加入106个脾细胞，加入FcR阻断剂1 μg，混匀，室温孵育15 min；加入CD3e、CD4、CD25各1 μg，混匀，室温避光孵育30 min；加2 mL预冷的含1%FBS的PBS，500×g，5 min；弃上清，混匀；加入1 mL新鲜制备的eBioscience Fixation/Permeabilization应用液（1×）；混匀，室温避光孵育60 min；加入2 mL Permeabilization Buffer（1×），500×g，5 min；弃上清，混匀，再重复此步骤1次；加入100 μL Permeabilization Buffer（1×）、1 μg Foxp3-APC和1 μg RORγt-BV421混匀，4 ℃避光30 min；加入2 mL Permeabilization Buffer（1×）500×g，5 min；弃上清液，混匀；加2 mL含1%FBS的PBS，500×g，5 min；弃上清液，混匀；加入0.2 mL PBS（1%FBS），1 h内上机获取分析。

2.4 统计学分析

所有数据使用SPSS 20.0软件包进行数据分析处理，实验数据以均数±标准差（x±s）表示。实验数据符合正态性及方差齐性组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 自拟固胎煎对自然流产模型孕鼠胚胎丢失率的影响

与正常妊娠组相比，自然流产组、地屈孕酮组、中药高、中、低剂量组流产率均明显升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与自然流产组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组流产率均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），低剂量组流产率差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组流产率均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），且组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

3.2 自拟固胎煎对自然流产模型孕鼠Th17/CD4⁺、Treg/CD4⁺细胞的影响

与正常妊娠组相比，自然流产组、地屈孕酮组、高剂量组、中剂量组和低剂量组Th17/CD4⁺细胞数及Th17/Treg细胞百分率比值均明显升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与自然流产组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组Th17/CD4⁺细胞数及Th17/Treg细胞百分率比值均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），低剂量组Th17/CD4⁺细胞数及Th17/Treg细胞百分率比值差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组Th17/CD4⁺细胞数及Th17/Treg细胞百分率比值均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），且中药中剂量组、高剂量组、地屈孕酮组3组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

与正常妊娠组相比，自然流产组、地屈孕酮组、高剂量组、中剂量组和低剂量组Treg/CD4⁺细胞数均明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与自然流产组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组Treg/CD4⁺细胞数均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），低剂量组Treg/CD4⁺细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组Treg/CD4⁺细胞数均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），且中药中剂量组、高剂量组、地屈孕酮组3组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2、图 1和图 2。

4 讨论

Th17细胞是一种新型CD4⁺效应性T细胞亚群，近年来已成为不明原因复发性流产RSA机制研究的一大热点。研究发现，在妊娠期，母胎界面同种异体的胚胎抗原刺激产生的炎性介质，系统性炎症以及增加的炎性细胞因子均可能诱发Th17细胞的分化。蜕膜中的NK细胞能够通过IFN-y通路抑制Th17调节的局部炎性反应。RSA的女性患者中，NK细胞介导的调节功能丧失，Th17细胞比例明显增加，导致Th17细胞引起的局部炎症显著加剧，并最终导致母体容受性的丧失^[4]。

Treg主要分为胸腺发育的天然调节T细胞（nTreg）和来源于外周的诱导性调节T细胞（iTreg）。在妊娠小鼠和人类，当母体免疫细胞第1次接触与侵入滋养层有关的胎儿抗原时，Treg的扩增发挥了关键的保护作用。Treg细胞可抑制母体对同种异体移植物胎儿的免疫反应，并在此过程中发挥重要作用，利用细胞的调节免疫，加速耐受的形成和维持妊娠^{[5, 13]}。

Th17和Treg细胞在母-胎免疫耐受方面具有关键性的调节作用，Th17细胞分泌促炎因子，促进炎症反应；Treg细胞分泌抗炎因子，抑制免疫反应，两者虽然在功能上有拮抗作用，但在起源上具有同源性^[14]，它们在不同的细胞因子作用下由CD4⁺T细胞分化而来，在一定条件下Th17细胞和Treg细胞可相互转化^[15-16]。一旦Th17/Treg平衡被打破，无论是Th17细胞增多还是Treg细胞减少，都有可能导致胚胎排斥的发生^[17]。

孕激素补充是目前临床治疗RSA的常规治疗手段。研究认为，在一定孕激素水平下，孕激素受体阳性的淋巴细胞和蜕膜CD56⁺细胞可分泌孕激素诱导封闭因子（PIBF），诱导Th1/Th2平衡向Th2型转化，从而使Th17/Treg下调，增强母体免疫耐受，从而有利于妊娠^[18-19]。本研究使用地屈孕酮作为阳性对照药，结果发现地屈孕酮组孕鼠的胚胎丢失率显著低于自然流产组，且Th17细胞、Treg细胞及其比例与自然流产组相比差异均有统计学意义，结果与文献相符。

复发性流产属于中医“滑胎”的范畴，临床公认的病机为脾肾两虚，气血不足，自拟固胎煎以补肾健脾，益气养血安胎为法，是在经方寿胎丸基础上化裁而来，方中菟丝子滋补肝肾、固精安胎为君药，桑寄生、覆盆子补肝肾，固精益血，白术、茯苓健脾益气，且茯苓能宁心安神，以上诸药合用共为臣药，亦补先天生化之本以补肾安胎，又健后天气血化生之源以安胎，女贞子、墨旱莲补肾滋阴，清热凉血，苎麻根清热安胎，以防补益药物的温补滋腻，莲须固肾涩精，四者合为佐药。诸药合用，共奏补肾健脾，清热安胎之效。纵观全方配伍精当，既补先天后天的脾肾以滋两脏之精气，又益气补血以载胎养胎，使养胎有源，固胎有力，配以清热凉血药物，合增安胎之功。本研究发现，自拟固胎煎中剂量组、高剂量组均可下调脾脏中Th17细胞的比例，上调Treg细胞比例，促使Th17/Treg平衡向Treg方向移动，降低自然流产小鼠的胚胎丢失率，效果与地屈孕酮相当，可于临床推广。