天津中医药  2020, Vol. 37 Issue (9): 1062-1066 |
复发性流产（RSA）是生育障碍的常见病症之一，临床亦称习惯性流产，主要是与相同性伴侣在妊娠20周内连续有超过2次的自然流产的现象[1]。
RSA是生殖领域的一大难点，越来越受到临床重视及关注。RSA的明确病因包括父母染色体异常（如平衡易位携带者等）、母亲子宫结构异常、内分泌异常、自身免疫异常（如抗磷脂抗体综合征）等，但仍有40%的人群无法明确病因[2]，并且直接影响临床治疗方法及效果。目前对于复发性流产的研究热点聚焦于免疫排斥及免疫耐受。正常妊娠是一个类似于同种异体移植的复杂生理过程。胎儿携带的父源性白细胞组织相容性抗原（HLA）不被母体免疫系统排斥的关键，在于母胎间的免疫耐受关系。母-胎免疫耐受微环境失调是复发性流产的重要影响因素[3]。既往的研究认为，Th1/Th2细胞因子的平衡是维持生理性妊娠所必需的，其中Th1细胞诱导细胞免疫反应，与组织损伤相关，可抑制胚胎着床、滋养细胞生长和胚胎的发育，不利于妊娠的维持；Th2细胞介导B淋巴细胞增殖、抗体产生和同种免疫耐受作用[4]。近年来，辅助性T细胞家族的新成员Th17细胞，与介导免疫耐受的调节性T细胞，两者平衡的相关研究备受关注。Th17细胞可引起母胎界面剧烈的局部炎症，导致母体容受性降低，继而发生流产[5]。而介导免疫耐受的Treg细胞由于其存在免疫无能及免疫抑制的作用特点，可抑制母体对胎儿的免疫反应，进而维持妊娠[6]。有越来越多的证据表明，Treg和Th17细胞分别作为调节性和效应性细胞，参与了妊娠的建立与维持[7-10]。
目前临床对于复发性流产的常规西医治疗是补充孕激素。中医方面，复发性流产的病机主要责之脾肾两虚，气血不足。临床诸家报道多以健脾益肾、益气养血安胎为基本治疗大法[11-12]。基于此，本研究采用自然流产模型小鼠，观察中药自拟固胎煎对流产小鼠模型胚胎丢失率及Th17/Treg细胞的影响，探讨健脾益肾、益气养血安胎中药固胎煎对复发性流产的治疗机制及作用机制。
1 实验动物与试剂 1.1 动物SPF级CBA/J雌鼠48只，BALB/C雄鼠4只，DBA/2雄鼠20只，周龄8~10周，体质量（20±2）g。CBA/J雌鼠购于北京华阜康生物科技有限公司[许可证号：SCXK（京）2014-0004]；BALB/C雄鼠、DBA/2雄鼠购于北京维通利华生物科技有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0006]。
1.2 药物自拟固胎煎组成：桑寄生10 g，菟丝子15 g，覆盆子10 g，苎麻根9 g，白术10 g，茯苓10 g，女贞子15 g，墨旱莲10 g，莲须6 g，中药饮片购于北京中医药大学东方医院。制备：用8倍水浸泡，过夜，先煮沸30 min，倒出药液，再加入8倍水，煮沸20 min，最后再加5倍水，煮沸20 min，合并药液并减压浓缩，最后配制成自拟固胎煎煎剂（含生药1.425 g/mL），置-20 ℃冰箱备用。地屈孕酮溶液：由地屈孕酮片[Abbott Biologicals B.V.（荷兰）；批号：H20130110；规格：10 mg/片] 3片溶于200 mL蒸馏水制成，稀释至1.5×10-4 mg/mL，置-20 ℃冰箱备用。
1.3 试剂及仪器小鼠淋巴细胞分离液（产品编号为：DKW33-R100），购自达科为生物工程有限公司；Fox P3-APC（17-5773-82）和Foxp3 Staining Buffer Set（00-5523-00），购自eBioscience公司；CD3e -PerCP-Cy5.5（561163），CD4-FITC（553047），CD25-PE（553866），Fox P3-APC（17-5773-82），RORγt-BV421（562894），FcR阻断剂（CD16/32）（553142），含1%FBS的磷酸缓冲盐溶液（PBS）和溶血素（349202），购自BD PMG公司；流式细胞仪（FacsCalibur，美国BD公司）。
2 方法 2.1 造模、分组及给药将CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠2:1合笼，建立正常妊娠模型（CBA/J×BALB/c组），CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠2:1合笼，建立自然流产模型（CBA/J×DBA/2组）。每天20:00开始合笼，早上8:00检查阴栓，肉眼观察阴道口有无乳白色、固态胶状物，发现明显阴栓者为阳性。检出阴栓的小鼠计为妊娠第0天。正常妊娠组予0.9%生理盐水灌胃；自然流产模型组孕鼠随机分为自然流产组、地屈孕酮组、中药低剂量组（低剂量组）、中药中剂量组（中剂量组）、中药高剂量组（高剂量组），每组8只。自然流产组予0.9%生理盐水灌胃，地屈孕酮组予地屈孕酮溶液灌胃，中药低、中、高剂量组分别给予7.125、14.25、28.5 g/kg自拟固胎煎汤剂灌胃，每组灌胃量均稀释至0.4 mL，连续灌胃2周，每日1次。
2.2 胚胎吸收率的计算孕14 d断颈处理小鼠，迅速解剖，用镊子撕开子宫，记录被吸收的胚胎数和存活胚胎数。胚胎丢失的判断标准：丢失之胚胎体积明显缩小，胎儿胎盘单位有明显出血或坏死。胚胎丢失率（ELR）的计算方法按下列公式进行：ELR=丢失胚胎数/（丢失胚胎数+存活胚胎数）×100%。
2.3 流式细胞检测脾脏Th17、Treg细胞含量流式细胞仪检测孕鼠脾脏Th17/CD4+、Treg/CD4+细胞。研磨脾脏，并用淋巴分离液分离脾脏细胞，在试管中加入106个脾细胞，加入FcR阻断剂1 μg，混匀，室温孵育15 min；加入CD3e、CD4、CD25各1 μg，混匀，室温避光孵育30 min；加2 mL预冷的含1%FBS的PBS，500×g，5 min；弃上清，混匀；加入1 mL新鲜制备的eBioscience Fixation/Permeabilization应用液（1×）；混匀，室温避光孵育60 min；加入2 mL Permeabilization Buffer（1×），500×g，5 min；弃上清，混匀，再重复此步骤1次；加入100 μL Permeabilization Buffer（1×）、1 μg Foxp3-APC和1 μg RORγt-BV421混匀，4 ℃避光30 min；加入2 mL Permeabilization Buffer（1×）500×g，5 min；弃上清液，混匀；加2 mL含1%FBS的PBS，500×g，5 min；弃上清液，混匀；加入0.2 mL PBS（1%FBS），1 h内上机获取分析。
2.4 统计学分析所有数据使用SPSS 20.0软件包进行数据分析处理，实验数据以均数±标准差（x±s）表示。实验数据符合正态性及方差齐性组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 自拟固胎煎对自然流产模型孕鼠胚胎丢失率的影响与正常妊娠组相比，自然流产组、地屈孕酮组、中药高、中、低剂量组流产率均明显升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与自然流产组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组流产率均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），低剂量组流产率差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组流产率均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），且组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
与正常妊娠组相比，自然流产组、地屈孕酮组、高剂量组、中剂量组和低剂量组Th17/CD4+细胞数及Th17/Treg细胞百分率比值均明显升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与自然流产组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组Th17/CD4+细胞数及Th17/Treg细胞百分率比值均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），低剂量组Th17/CD4+细胞数及Th17/Treg细胞百分率比值差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组Th17/CD4+细胞数及Th17/Treg细胞百分率比值均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），且中药中剂量组、高剂量组、地屈孕酮组3组间差异无统计学意义（P＞0.05）。
与正常妊娠组相比，自然流产组、地屈孕酮组、高剂量组、中剂量组和低剂量组Treg/CD4+细胞数均明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与自然流产组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组Treg/CD4+细胞数均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），低剂量组Treg/CD4+细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组和地屈孕酮组Treg/CD4+细胞数均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），且中药中剂量组、高剂量组、地屈孕酮组3组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2、图 1和图 2。
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| 注：A：正常妊娠组，B：多发性流产组，C：地屈孕酮组，D：低剂量组，E：中剂量组F：高剂量组。 图 1 各组孕鼠脾脏中Th17/CD4+的细胞流式图 Fig. 1 Cell flow diagram of Th17/CD4+ in spleen of pregnant mice in each group |
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| 注：A正常妊娠组，B：复发性流产组，C：地屈孕酮组，D：低剂量组，E：中剂量组，F：高剂量组。 图 2 各组孕鼠脾脏中Treg/CD4+的细胞流式图 Fig. 2 Cell flow diagram of Treg/CD4+ in spleen of pregnant mice in each group |
Th17细胞是一种新型CD4+效应性T细胞亚群，近年来已成为不明原因复发性流产RSA机制研究的一大热点。研究发现，在妊娠期，母胎界面同种异体的胚胎抗原刺激产生的炎性介质，系统性炎症以及增加的炎性细胞因子均可能诱发Th17细胞的分化。蜕膜中的NK细胞能够通过IFN-y通路抑制Th17调节的局部炎性反应。RSA的女性患者中，NK细胞介导的调节功能丧失，Th17细胞比例明显增加，导致Th17细胞引起的局部炎症显著加剧，并最终导致母体容受性的丧失[4]。
Treg主要分为胸腺发育的天然调节T细胞（nTreg）和来源于外周的诱导性调节T细胞（iTreg）。在妊娠小鼠和人类，当母体免疫细胞第1次接触与侵入滋养层有关的胎儿抗原时，Treg的扩增发挥了关键的保护作用。Treg细胞可抑制母体对同种异体移植物胎儿的免疫反应，并在此过程中发挥重要作用，利用细胞的调节免疫，加速耐受的形成和维持妊娠[5, 13]。
Th17和Treg细胞在母-胎免疫耐受方面具有关键性的调节作用，Th17细胞分泌促炎因子，促进炎症反应；Treg细胞分泌抗炎因子，抑制免疫反应，两者虽然在功能上有拮抗作用，但在起源上具有同源性[14]，它们在不同的细胞因子作用下由CD4+T细胞分化而来，在一定条件下Th17细胞和Treg细胞可相互转化[15-16]。一旦Th17/Treg平衡被打破，无论是Th17细胞增多还是Treg细胞减少，都有可能导致胚胎排斥的发生[17]。
孕激素补充是目前临床治疗RSA的常规治疗手段。研究认为，在一定孕激素水平下，孕激素受体阳性的淋巴细胞和蜕膜CD56+细胞可分泌孕激素诱导封闭因子（PIBF），诱导Th1/Th2平衡向Th2型转化，从而使Th17/Treg下调，增强母体免疫耐受，从而有利于妊娠[18-19]。本研究使用地屈孕酮作为阳性对照药，结果发现地屈孕酮组孕鼠的胚胎丢失率显著低于自然流产组，且Th17细胞、Treg细胞及其比例与自然流产组相比差异均有统计学意义，结果与文献相符。
复发性流产属于中医“滑胎”的范畴，临床公认的病机为脾肾两虚，气血不足，自拟固胎煎以补肾健脾，益气养血安胎为法，是在经方寿胎丸基础上化裁而来，方中菟丝子滋补肝肾、固精安胎为君药，桑寄生、覆盆子补肝肾，固精益血，白术、茯苓健脾益气，且茯苓能宁心安神，以上诸药合用共为臣药，亦补先天生化之本以补肾安胎，又健后天气血化生之源以安胎，女贞子、墨旱莲补肾滋阴，清热凉血，苎麻根清热安胎，以防补益药物的温补滋腻，莲须固肾涩精，四者合为佐药。诸药合用，共奏补肾健脾，清热安胎之效。纵观全方配伍精当，既补先天后天的脾肾以滋两脏之精气，又益气补血以载胎养胎，使养胎有源，固胎有力，配以清热凉血药物，合增安胎之功。本研究发现，自拟固胎煎中剂量组、高剂量组均可下调脾脏中Th17细胞的比例，上调Treg细胞比例，促使Th17/Treg平衡向Treg方向移动，降低自然流产小鼠的胚胎丢失率，效果与地屈孕酮相当，可于临床推广。
| [1] |
吴佩蔚, 胡旭, 崔莹, 等. 复发性流产与夫妇染色体异常及多态性的关系[J]. 实用预防医学, 2020, 27(1): 78-80. WU P W, HU X, CUI Y, et al. Relationship between recurrent abortion and chromosomal abnormality and polymorphism in couples[J]. Practical Preventive Medicine, 2020, 27(1): 78-80. |
| [2] |
苏亚芳. 复发性流产的病因分析及治疗新进展[J]. 世界最新医学信息文摘, 2019, 19(58): 43-44. SU Y F. New progress in etiology analysis and treatment of recurrent abortion[J]. World Latest Medicine Information, 2019, 19(58): 43-44. |
| [3] |
杨卓轩, 卞姝晨. 妊娠时母体子宫淋巴细胞的免疫调节[J]. 黑龙江科学, 2019, 10(16): 50-51. YANG Z X, BIAN S C. Immune regulation of maternal uterine lymphocytes during pregnancy[J]. Heilongjiang Science, 2019, 10(16): 50-51. |
| [4] |
李莉, 乔杰, 王海燕. 不明原因复发性流产免疫学发病机制的研究进展[J]. 中华生殖与避孕杂志, 2017, 37(2): 160-165. LI L, QIAO J, WANG H Y. Research progress in immunological pathogenesis of unexplained recurrent abortion[J]. Chinese Journal of Reproduction and Contraception, 2017, 37(2): 160-165. |
| [5] |
AHMADI M, GHAEBI M, ABDOLMOHAMMADI V S, et al. NK cell frequency and cytotoxicity in correlation to pregnancy outcome and response to IVIG therapy among women with recurrent pregnancy loss[J]. Journal of Cellular Physiology, 2019, 234(6): 9428-9437. DOI:10.1002/jcp.27627 |
| [6] |
WANG J, YANG J, YAN Y Q, et al. Effect of adoptive transfer of CD4+CD25+Foxp3+ Treg induced by trichostatin A on the prevention of spontaneous abortion[J]. Journal of Reproductive Immunology, 2019, 131: 30-35. DOI:10.1016/j.jri.2018.12.002 |
| [7] |
冯晓玲, 贾丹, 李杨, 等. 补肾活血方对不明原因复发性流产患者外周血中辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响[J]. 中国医药, 2019, 14(11): 1699-1702. FENG X L, JIA D, LI Y, et al. The effect of Bushen Huoxue Recipe on the balance of helper T cell 17/regulatory T cell in peripheral blood of patients with unexplained recurrent abortion[J]. China Medicine, 2019, 14(11): 1699-1702. |
| [8] |
文妍琪, 杨菁. 不明原因复发性流产机制中Th17细胞和CD4+CD25+调节性T细胞的研究进展[J]. 生殖医学杂志, 2019, 28(7): 831-835. WEN Y Q, YANG J. Research progress of Th17 cells and CD4+ CD25+ regulatory T cells in the mechanism of unexplained recurrent abortion[J]. Journal of Reproductive Medicine, 2019, 28(7): 831-835. |
| [9] |
MUYAYALO K P, LI Z H, MOR G, et al. Modulatory effect of intravenous immunoglobulin on Th17/Treg cell balance in women with unexplained recurrent spontaneous abortion[J]. American Journal of Reproductive Immunology, 2018, 80(4): 13018. DOI:10.1111/aji.13018 |
| [10] |
ZHU L Q, CHEN H, LIU M L, et al. Treg/Th17 Cell Imbalance and IL-6 Profile in Patients With Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion[J]. Reproductive Sciences, 2017, 24(6): 882-890. DOI:10.1177/1933719116670517 |
| [11] |
陈颖颖, 赵宏利. 赵宏利治疗NK细胞异常复发性流产经验[J]. 浙江中医药大学学报, 2019, 43(5): 471-473. CHEN Y Y, ZHAO H L. ZHAO Hongli's experience in the treatment of recurrent abortion with abnormal NK cells[J]. Journal of Zhejiang Chinese Medical University, 2019, 43(5): 471-473. |
| [12] |
樊琼茵, 奚婷, 熊彩君, 等. 吴克明教授治疗复发性流产经验简介[J]. 世界最新医学信息文摘, 2017, 17(95): 181-182. FAN Q Y, XI T, XIONG C J, et al. Professor WU Keming's experience in the treatment of recurrent abortion[J]. World Latest Medicine Information, 2017, 17(95): 181-182. |
| [13] |
DU M R, GUO P F, PIAO H L, et al. Embryonic trophoblasts induce decidual regulatory T cell differentiation and maternal-fetal tolerance through thymic stromal lymphopoietin instructing dendritic cells[J]. Immunol, 2014, 192(4): 1502-1511. DOI:10.4049/jimmunol.1203425 |
| [14] |
HEINK S, YOGEV N, GARBERS C, et al. Corrigendum:Trans-presentation of IL-6 by dendritic cells is required for the priming of pathogenic T(H)17 cells[J]. Nature Immunology, 2017, 18(4): 474-474. |
| [15] |
ANDERSEN L, GUELICH A, ALTENEDER M, et al. The transcription factor MAZR/PATZ1 regulates the development of FOXP3(+) regulatory T cells[J]. Cell Reports, 2019, 29(13): 4447-4447. DOI:10.1016/j.celrep.2019.11.089 |
| [16] |
Bellemore S M, Nikoopour E, Schwartz J A, et al. Preventative role of interleukin-17 producing regulatory T helper type 17(Treg17) cells in type 1 diabetes in non-obese diabetic mice[J]. Clinical and Experimental Immunology, 2015, 182(3): 261-269. DOI:10.1111/cei.12691 |
| [17] |
钱金凤, 李大金, 王凌. Treg/Th17在不明原因复发性流产中的作用机制[J]. 中华生殖与避孕杂志, 2017, 37(11): 942-946. QIAN J F, LI D J, WANG L. Mechanism of Treg/Th17 in unexplained recurrent abortion[J]. Chinese Journal of Reproduction and Contraception, 2017, 37(11): 942-946. |
| [18] |
徐子衿. 不明原因复发性流产的治疗进展[J]. 中国计划生育学杂志, 2018, 26(3): 233-238. XU Z J. Treatment progress of unexplained recurrent abortion[J]. Chinese Journal of Family Planning, 2018, 26(3): 233-238. |
| [19] |
张秋月, 邹健军. 不明原因复发性流产使用黄体酮治疗的可行性研究[J]. 齐齐哈尔医学院学报, 2016, 37(29): 3644-3645. ZHANG Q Y, ZOU J J. Feasibility study of progesterone in the treatment of unexplained recurrent abortion[J]. Journal of Qiqihar Medical University, 2016, 37(29): 3644-3645. |
表1(Table 1)
