糖尿病肾病（DKD）是终末期肾病最常见的病因，临床主要表现为尿蛋白渐进性增多及肾功能的逐步减退^[1]。足细胞是肾小球脏层上皮细胞，对维持肾小球的结构、形态、滤过屏障的正常功能有重要作用。足细胞损伤会影响肾小球滤过功能，导致蛋白尿出现^[2]。近年研究发现，酪氨酸蛋白激酶/信号转导与转录激活子（JAK-STAT）途径与DKD进行性发展密切相关。在早期和进展性DKD的肾脏多种细胞中（包括肾小球足细胞）均发现JAK-STAT基因表达增加^[3]。在糖尿病小鼠的足细胞中选择性过表达JAK2 mRNA，最终导致小鼠肾功能恶化，尿蛋白增多；而给予特异性JAK1/2抑制剂后，小鼠尿蛋白排泄改善，且与DKD进展有关的多种下游基因如STAT3等正常表达^[4]。

目前，特异性JAK1/2抑制剂还仍处实验阶段，现有西医治疗DKD的方法近20年未有明显变化^[5]。中医药是中国传统瑰宝，黄连是清热药，在治疗消渴的方剂中多有使用，魏晋时的《名医别录》就有“黄连止消渴”的记载^[6]。黄连素是由中药黄连等中提取出的生物碱，循证医学证据表明，黄连素通过降低血糖、胆固醇、C-反应蛋白的作用，不但降低血液黏稠度，从血流动力学方面改善肾小球的滤过能力，还可以减少对血管包括微血管的损害，治疗DKD，降低尿蛋白^[7]。黄连素也能改善足细胞的结构和功能、抑制足细胞凋亡，其机制目前集中于抑制TLR4/NF-κB^[8]、PI3K-Akt^[9]通路活性，增强腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）活性^[10]等方面。但黄连素改善足细胞功能的作用是否与JAK-STAT途径相关尚不清晰，因此本研究拟进行探讨，为临床重用黄连治疗DKD提供更多实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

黄连素、二甲基亚砜（DMSO）、干扰素-γ（IFN-γ）、转化生长因子-β1（TGF-β1）购自Sigma公司，青链霉素双抗混合液、0.25%胰蛋白酶购自Solarbio公司，RPMI 1640购自Hyclon公司，胎牛血清购自Gibco公司，总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、定量聚合酶链反应（qPCR）试剂盒购自北京康为世纪有限公司。小鼠来源JAK2（AHO1352）和STAT3（MA1-13042）单抗购自Thermo Fisher Scientific公司，兔来源磷酸化JAK2（phospho Tyr1007，GTX32203）和磷酸化STAT3（phospho Tyr705，GTX24740）多抗购自GeneTex公司。

所用仪器为Nikon光学显微镜、Bio-Tek酶标仪、Bio-rad凝胶图像分析系统、ABI 7500型荧光定量PCR仪等。

1.2 方法 1.2.1 足细胞培养和分组

将冻存的MPC-5条件永生化小鼠足细胞复苏，在含有10 U/mL IFN-γ、10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的RPMI 1640培养液中，33 ℃、5%CO₂培养箱传代。传代后在37 ℃、5%CO₂培养箱内用无IFN-γ的培养基培养10~14 d使细胞分化。

将细胞分为正常糖浓度组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖浓度组（30 mmol/L葡萄糖）、高糖+10 μmol/L黄连素组、高糖+25 μmol/L黄连素组和高糖+50 μmol/L黄连素组。正常糖浓度组常规培养；其余各组使用相应培养基培养48 h。

1.2.2 噻唑蓝（MTT）法检测足细胞存活率

取对数生长期的细胞，调整密度为1×10⁵/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞融合后，更换无血清培养基继续培养8 h使细胞同步。按上述实验分组，加入相应培养基继续培养48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，混匀10 min，采用酶标仪于490 nm测定各孔的吸光度，计算细胞存活率。每组设5个复孔。

1.2.3 Transwell实验检测足细胞迁移能力

取对数生长期的细胞，调整密度为1×10⁵/mL，采用24孔transwell小室，上室加入200 μL细胞悬液，下室中加入600 μL完全培养基，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞融合后，更换无血清培养基继续培养8 h使细胞同步。按上述实验分组，加入相应培养基继续培养48 h后，取出小室，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗，结晶紫染色，将上室中的细胞用棉签擦去，倒置显微镜下观察，每个样本随机选取10个视野，计算每个视野的细胞数。

1.2.4 白蛋白流量率检测法测定足细胞屏障功能

取对数生长期的细胞，调整密度为1×10³/mL，采用24孔transwell小室，上室加入200 μL细胞悬液，下室中加入600 μL完全培养基，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞融合后，更换无血清培养基继续培养8 h使细胞同步。按上述实验分组，加入相应培养基继续培养48 h后，1×PBS洗涤2次，然后给上室更换完全培养基，下室更换含有40 mg/mL小牛血清白蛋白的完全培养基，于37 ℃培养1 h后，取上层培养液，BCA法测定上层培养基中的白蛋白浓度。

1.2.5 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测基因表达

收集各组细胞，提取总RNA后测定纯度和浓度，将总RNA逆转录为cDNA。将cDNA、上下游引物、荧光染料等加入反应体系中，RT-qPCR法检测。PCR反应条件为件：95 ℃预变性10 min；变性95 ℃ 5 s；退火、延伸60 ℃ 34 s；重复40个循环，70~95 ℃绘制融解曲线。反应体系为25 μL。引物由苏州金维智公司合成。引物序列：JAK2为5’-CGTCTC- GGAGGAGCGGAT-3’和5’-CTGGGGAGGGAAAA- CAGTTCA-3’；STAT3为5’-CGGATCGCTGAGGT- ACAACC-3’和5’-TCAGGGGTCTCGACTGT-3’。GAPDH为5’-CTGCTCCTCCCTGTTCCA-3’和5’-TGGCAACAATCTCCACTTTGC-3’。所有样品重复检测3次，2^-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

1.2.6 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测蛋白表达

收集各组细胞，RIPA提取液提取总蛋白，BCA法定量后，蛋白样品进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，分别与JAK2（1:1 000）、p-JAK2（1:1 000）、STAT3（1:1 000）、p-STAT3（1:1 000）的Ⅰ抗杂交，再经与HRP标记的Ⅱ抗杂交、化学发光显色等步骤，Bio-rad凝胶图像分析系统测定光密度值。每个样品重复测量3次，取均值分析。实验以β-actin作为内参照物。

2 统计分析

使用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析；组间多重比较采用LSD法（方差齐）/Dunnett’s T3法（方差不齐）。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 对足细胞存活率的影响

与正常糖浓度组相比，高糖刺激后足细胞存活率明显降低（P < 0.01），而黄连素各组能不同程度促进足细胞存活，且呈浓度依懒性（P < 0.05，P < 0.01）。但黄连素25 μmol/L组与50 μmol/L组差异无统计学意义，见表 1。

3.2 对足细胞迁移能力的影响

与正常糖浓度组相比，高糖刺激能明显增加足细胞的迁移能力（P < 0.01），黄连素各组能明显减少足细胞迁移，且呈浓度依懒性（P < 0.05，P < 0.01）。但黄连素25 μmol/L组与50 μmol/L组差异无统计学意义，见表 2。

3.3 对白蛋白流量率的影响

白蛋白流量率体现了足细胞的屏障功能。与正常糖浓度组相比，高糖刺激增加了白蛋白的渗漏，提示糖浓度提高削弱了足细胞单层屏障功能（P < 0.01）；而黄连素各组能不同程度降低白蛋白渗漏，说明黄连素能增强足细胞的屏障功能，且呈浓度依懒性（P < 0.05或P < 0.01）。但黄连素25 μmol/L组与50 μmol/L组差异无统计学意义，见表 3。

3.4 对JAK2和STAT3 mRNA表达的影响

与正常糖浓度组相比，高糖刺激能增加JAK2和STAT3 mRNA表达量（P < 0.01）；而黄连素各组能不同程度降低其表达，且呈浓度依赖性（P < 0.05或P < 0.01）。但黄连素25 μmol/L组与50 μmol/L组差异无统计学意义，见表 4。

3.5 对JAK2和STAT3蛋白表达的的影响

与正常糖浓度组相比，高糖刺激增加JAK2和STAT3总蛋白及磷酸化蛋白的表达量（P < 0.05）；而黄连素各组能不同程度降低其总蛋白及磷酸化蛋白的表达量，且在一定程度上呈浓度依懒性（P < 0.05），见图 1。

4 讨论

足细胞是维持肾小球滤过屏障结构和功能完整的重要细胞。足细胞是肾小球脏层上皮细胞，高糖、糖基化终末产物、转化生长因子-β（TGF-β）等都可损伤足细胞，导致其向间充质细胞转分化并获得分泌功能，分泌细胞外基质增多，最终导致肾小球硬化^[11]。足细胞结构和功能的异常导致肾小管萎缩和功能损伤，是导致蛋白尿并促使DKD发生发展的关键因素，因此减轻足细胞损伤是治疗DKD的关键。

JAK-STAT信号通路的激活与DKD的发病密切相关。高糖、糖基化终末产物、血管紧张素Ⅱ、过氧化应激、血管内皮生长因子等多种能促进DKD发展发展的病理因素，均能激活JAK2/STAT3通路^[12]。在早期或进展性DKD患者中，肾小球和肾小管间质中JAK和STAT基因各亚型的表达均大幅增加^[3]。而baricitinib（JAK1和JAK2选择性抑制剂）可减少DKD患者的蛋白尿，甚至在停药4周后，中高剂量组减少蛋白尿的作用仍能维持^[5]。使小鼠足细胞过表达JAK2，发现对无糖尿病小鼠没有任何影响；但却导致糖尿病小鼠尿白蛋白明显增加、系膜扩张、足细胞密度减少、肾小球硬化和肾小球基底膜增厚。口服JAK1/JAK2抑制剂两周后，上述病理变化显著改善^[4]。给予STAT3活性降低的转基因小鼠以链脲佐菌素，使其发生糖尿病，该小鼠在蛋白尿、系膜扩张、细胞增殖、巨噬细胞浸润、炎症和异常基质合成等方面均降低^[13]；口服JAK1/JAK2抑制剂可使STAT3等许多与DKD进展有关的下游基因的表达恢复正常。上述研究结果提示，足细胞内JAK2及STAT3的活化及表达增加对DKD发生发展非常关键。本研究结果显示，高糖诱导使足细胞存活率降低、迁移能力提高；并使JAK2和STAT3 mRNA和蛋白表达量提高。提示高糖刺激损伤了足细胞的屏障功能，而这一作用与JAK2/STAT3通路活性升高相关。

黄连素是从黄连、黄柏等中药中提取出的一种生物碱，对与DKD密切相关的病理机制，如糖脂代谢、胰岛素抵抗^[14]、炎症^[8]、氧化损伤^[15]等均有改善；因而具有良好的肾保护作用。黄连素能有效缓解早期DKD患者的临床症状，降低其空腹血糖、糖化血红蛋白及尿微量白蛋白排泄率^[16]。黄连素能降低链脲佐菌素诱导的DKD大鼠的空腹血糖、肾质量体质量比、24 h尿蛋白、血肌酐和血尿氮水平；还可减轻DKD大鼠全身及肾脏的炎症反应^[8]。黄连素可抑制由高糖所导致的肾小球系膜细胞的增殖与肥大、改善肾小球纤维化，其机制涉及调节细胞周期蛋白表达，使细胞周期停滞于G1期^[17]；抑制鞘氨醇激酶-1-磷酸鞘氨醇（SphK/S1P）通路活性^[18]；抑制激活蛋白1（AP-1）活化^[19]；抑制核因子κB（NF-κB）的核移位和转录活性，进而抑制其下游靶基因转录^[20]等多种信号通路。黄连素对足细胞也有保护作用，其改善足细胞的结构和功能、抑制足细胞凋亡的机制与抑制TLR4/NF-κB^[8]、PI3K-Akt^[9]通路，增强AMPK活性^[10]等有关。最新研究表明，黄连素可以通过降低动力相关蛋白1（Drp1）激活来保护足细胞线粒体的结构与功能，从而使足细胞免于凋亡^[21]。但目前尚未见黄连素调节JAK-STAT通路进而保护足细胞的相关报道。本研究结果表明，黄连素对高糖引起的足细胞功能损伤具有明显的保护作用，黄连素各浓度均能提高足细胞的存活率，减少其迁移能力，改善其屏障功能；且均能降低JAK2和STAT3 mRNA及蛋白的表达。本研究结果与前人研究结果一致，均发现过表达JAK2导致足细胞密度减少；且也证实黄连素对足细胞屏障功能的改善作用，与调节JAK-STAT通路活性相关。

综上所述，黄连素能保护高糖诱导的足细胞损伤，提高足细胞在高糖环境下的存活率、降低其迁移率，维持其屏障功能，其机制可能与调控JAK2和STAT3基因与蛋白表达有关。