肝癌是威胁中国人民生命健康的主要恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第4位、病死率居第3位^[1]。手术切除并辅以放化疗是临床治疗肝癌的首选方案，但术后5年复发率超过60%、5年生存率不足40%^[2]。中医药抗肿瘤逐渐得到人们的关注与认可，葛根素（Puerarin）是从中药葛根中提取的1类具有异黄酮类化合物，包括葛根素、胡萝卜苷、β-谷甾醇等活性成分，呈白色至微黄色结晶性粉末、微溶于水，具有抗炎、抗氧化、降血压、调节血脂、抗心律失常等多种药理学作用^[3]。近年来葛根素抗肿瘤活性很受关注，对胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌等均具有一定的抑制作用^[4]。阻滞肿瘤细胞周期进程、诱导肿瘤细胞凋亡和自噬是葛根素抗肿瘤的作用机制^[5-6]。本实验以临床治疗肝癌一线化疗用药顺铂为阳性对照，设葛根素3个剂量组进行干预，研究不同剂量葛根素对人肝癌HepG2细胞凋亡、自噬的影响并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法 1.1 细胞

人肝癌HepG2细胞购自上海中科院细胞库。HepG2细胞接种于含10%胎牛血清和双抗（100 U/mL链霉素-青霉素）的DMEM培养基，置细胞培养箱（37℃、5% CO₂）中进行培养，细胞贴壁生长，细胞汇合度约80%时进行传代。取第3代对数生长期HepG2细胞开展实验研究，设空白组、葛根素（50、100、200 μg/mL）组和顺铂20 μg/mL组^[7-8]。

1.2 药物与试剂

葛根素购自上海源叶生物科技有限公司（纯度≥99%，批号：B21028）；注射用顺铂购自齐鲁制药有限公司（国药准字H37021357，规格20 mg/支，批号：1905016）；DMEM培养基、二甲基亚砜（DMSO）、胰酶、胎牛血清购自上海源叶生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、山羊抗兔IgG二抗购自上海碧云天生物技术研究所；兔抗人蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、激活型半胱氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、酵母ATG6同源物（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 主要仪器

BB15型细胞培养箱（德国Heraeus公司）；LB940型酶标仪（德国Berthold公司）；SE300型电泳仪、TE22型转膜仪（美国Hoefer公司）；FACSAria型流式细胞仪（美国BD公司）；BX53型荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.4 细胞增殖抑制率检测

取对数生长期HepG2细胞，消化、重悬并计数后调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，100 μL/孔接种于96孔培养板，培养24 h后更换培养液，并以DMSO（空白组）和终浓度（50、100、200 μg/mL）葛根素、20 μg/mL顺铂进行干预，每组设10个复孔，继续培养48 h后每孔10 μL加入CCK-8溶液，放回培养箱继续培养2 h后通过酶标仪检测450 nm处吸光度值（A），细胞增殖抑制率（%）=（1-A_药物组/A_空白组）×100%

1.5 细胞凋亡水平检测

取浓度1×10⁵个/mL的HepG2细胞悬液，500 μL/孔接种于6孔细胞培养板，培养24 h后更换培养液，分组并分别以相应浓度药物进行干预，每组设10个复孔，继续培养48 h后通过不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化、离心（2 000 r/min，离心半径8 cm，5 min）收集细胞，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明依次处理，通过流式细胞仪分析细胞凋亡水平。

1.6 细胞自噬溶酶体水平检测

取浓度1×10⁵个/mL的HepG2细胞悬液，200 μL/孔接种于24孔板，培养24 h后更换培养液，分组并分别以相应浓度药物进行干预，每组设10个复孔，继续培养48 h后弃培养液、PBS洗涤3次，500 μL/孔滴加吖啶橙溶液（1 mg/L）避光孵育15 min，PBS洗涤3次后通过荧光显微镜观察（自噬溶酶体呈红色荧光）。

1.7 细胞蛋白表达检测

取对数生长期HepG2细胞，消化、重悬并计数后调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，每孔1 mL接种于60 mm培养皿，放回细胞培养箱继续培养24 h后更换培养液，分组并分别以相应浓度药物进行干预，每组设10个皿，继续培养48 h后消化、离心（2 000 r/min，离心半径8 cm，5 min）收集细胞，冰上裂解30 min，低温4 ℃离心（12 000 r/min，离心半径8 cm，15 min）取上清液，BCA法检测总蛋白浓度、95 ℃水浴10 min蛋白变性，取总蛋白30 μg行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、湿转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上、置5%蛋白免疫印迹封闭液室温封闭2 h，滴加Akt、p-Akt、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-mTOR、Beclin1、LC3、β-actin抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后滴加二抗室温孵育1 h，洗膜后滴加DAB显色，应用ImageJ软件进行分析，以β-actin为内参半定量目标蛋白相对表达量。

1.8 统计学处理

采用GraphPad prism 6软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法检测，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组HepG2细胞增殖抑制率比较

与空白组比较，葛根素50、100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组HepG2细胞增殖抑制率显著升高（P < 0.01）；与顺铂20 μg/mL组比较，葛根素200 μg/mL组细胞增殖抑制率升高（P < 0.05）。见表 1。

2.2 各组HepG2细胞凋亡水平比较

与空白组比较，葛根素50、100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组HepG2细胞凋亡数量明显增多，凋亡率显著升高（P < 0.01）；与顺铂20 μg/mL组比较，葛根素200 μg/mL组HepG2细胞凋亡率升高（P < 0.05）。见图 1、表 1。

2.3 各组HepG2细胞自噬水平比较

与空白组比较，葛根素50、100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组自噬溶酶体（亮红色荧光）呈不同程度增多，葛根素作用呈现一定剂量依赖性，葛根素200 μg/mL组自噬溶酶体数量明显多于其他组，提示葛根素具有诱导HepG2细胞自噬的作用。见图 2。

2.4 各组HepG2细胞Akt、p-Akt、p-mTOR表达及Akt磷酸化（p-Akt/Akt比值）比较

与空白组比较，葛根素100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组HepG2细胞p-Akt、p-mTOR表达明显下调（P < 0.01），Akt表达差异无统计学意义（P > 0.05），Akt磷酸化明显降低（P < 0.01）；与顺铂20 μg/mL组比较，葛根素200 μg/mL组p-Akt、p-mTOR表达下调（P < 0.05或P < 0.01），Akt磷酸化降低（P < 0.01）。见图 3、表 2。

2.5 各组HepG2细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3表达及Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比较

与空白组比较，葛根素100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组HepG2细胞Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达明显上调而Bcl-2表达下调（P < 0.01），Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高（P < 0.01）；与顺铂20 μg/mL组比较，葛根素200 μg/mL组Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅱ上调（P < 0.05或P < 0.01），两组间Bcl-2表达差异无统计学意义（P > 0.05），Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P < 0.05或P < 0.01）。见图 4、表 3和表 4。

3 讨论

肝癌是世界范围内常见恶性肿瘤之一，每年新发病例超过100万，其中40%以上的患者分布在中国，中国肝癌发病率居恶性肿瘤第四位、病死率居第3位^[9]。虽然近年来人民生活条件明显改善、乙型肝炎疫苗得到普及，但肝癌发病率并未出现下降趋势。因此，寻找新型高效的抗肝癌药物仍是目前医药工作者的研究热点。

肝癌在中医属“癥瘕”“臌胀”“黄疸”等范畴，中药葛根以豆科植物野葛的干燥根入药，收入《中国药典》，是长期应用于临床的中药品种，葛根素是提取自葛根的一种异黄酮类化合物，目前临床上主要用于缺血性心脑血管疾病的治疗，近年来葛根素抗肿瘤活性得到广泛关注。本实验研究发现，经葛根素干预能够明显提高人肝癌HepG2细胞增殖抑制率和凋亡率，诱导自噬溶酶体生成；葛根素200 μg/mL组效果优于顺铂20 μg/mL组，提示葛根素具有诱导HepG2细胞凋亡和自噬的药理学作用。

凋亡和自噬是细胞程序性自主死亡的两种主要途径，均由多种基因调控^[10]。线粒体介导的内源性凋亡途径由Bcl-2家族、Caspase家族蛋白等参与调控^[11]。肿瘤发病过程中，由于肿瘤细胞过度增殖但新生血管相对缺乏而局部缺氧，引发氧化应激、炎症反应、Ca²⁺超载等而病理性刺激Bcl-2家族蛋白Bax上调表达并移位到线粒体膜、导致膜通透性改变，细胞色素C（Cyt C）释放，从而启动细胞凋亡。Cyt C是Caspase家族蛋白的主要激活因子，其中Cleaved Caspase-3将通过剪切细胞结构蛋白等而诱导细胞凋亡，是细胞凋亡最重要的执行者；Bcl-2蛋白位于线粒体膜，能够与Bax形成异源二聚体而抑制Bax促凋亡活性，保护线粒体膜通透性，表现出抑凋亡活性^[12]。LC3蛋白位于于自噬溶酶体膜，能够与线粒体受体蛋白结合而诱导期降解，因此LC3可作为细胞自噬活性的标志蛋白^[13]。LC3以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种亚型存在，LC3-Ⅱ具有自噬活性，当细胞自噬发生时无活性的LC3-Ⅰ将转化为LC3-Ⅱ，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值能够反映细胞自噬水平^[14]。本研究发现，经葛根素干预能够明显上调人肝癌HepG2细胞Cleaved Caspase-3、Bax、LC3-I、LC3-Ⅱ表达并下调Bcl-2表达，提高Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，并且葛根素200 μg/mL组对上述蛋白表达的调节作用优于顺铂20 μg/mL组。

Akt是一种原癌基因，被磷酸化（p-Akt）激活后能够诱导Caspase家族蛋白磷酸化而失活，抑制Bax表达与转移^[15]。mTOR为Akt下游基因，能够被p-Akt诱导mTOR磷酸化（p-mTOR）而激活，进而诱导细胞周期素上调表达而促进细胞增殖、清除泛素蛋白而抑制细胞自噬^[16]。此外，p-mTOR能够诱导下游自噬特征蛋白Beclin1磷酸化而失活，Beclin1是介导LC3等自噬蛋白位移至自噬体的关键因子，从而间接促进细胞自噬^[17]。本研究发现，经葛根素干预能够明显下调p-Akt、p-mTOR表达并抑制Akt磷酸化，上调Beclin1表达，并且葛根素200 μg/mL组对p-Akt、p-mTOR、Beclin1表达及Akt磷酸化的调控作用优于顺铂20 μg/mL组，提示葛根素对HepG2细胞凋亡、自噬的调控作用可能与抑制Akt/mTOR/Beclin1通路有关。

综上所述，葛根素具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬的药理学作用，抑制Akt/mTOR/Beclin1通路进而诱导促凋亡、促自噬相关蛋白表达与活化可能是其重要的分子机制。本研究为体外细胞实验，结果提示葛根素具有较良好的抗肝癌细胞活性，但肝癌的发生发展具有复杂的病理机制，受多种因素影响，因此葛根素抗肝癌作用及相关机制仍需体内实验进一步研究。