2021, Vol. 38文章信息
- 刘云, 郭洁, 张曼玲, 时昭红
- LIU Yun, GUO Jie, ZHANG Manling, SHI Zhaohong
- 葱白提取物诱导PGC-1α活化非酒精性脂肪性肝病大鼠线粒体代谢的研究
- Study of fistular onion stalk extract activating mitochondrial metabolism on non-alcoholic fatty liver disease rats by inducing PGC-1α
- 天津中医药, 2021, 38(2): 247-253
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2021, 38(2): 247-253
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2021.02.22
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文章历史
- 收稿日期: 2020-10-20
2. 武汉市第一医院, 武汉 430022
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种与胰岛素抵抗（IR）和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征，包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化[1]。NAFLD除直接或通过促进并存的其他肝病的进展，导致肝衰竭和肝细胞癌（HCC）外，还参与2型糖尿病和动脉硬化的发病，是导致慢性肝病的重要原因之一[2]。
本课题组前期通过动物实验发现，中剂量（50 mg/kg）葱白提取物每日灌胃可显著改善NAFLD大鼠脂肪肝变性[3]，并通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）与过氧化物酶体增殖物受体γ辅助激活因子1α（PGC-1α）从而促进肝脏脂肪分解消耗[4]。近年来，随着线粒体功能障碍在NAFLD中的枢纽作用、转录辅助激活因子PGC-1α及其信号活化通路的发现[5]，调控此线粒体代谢关键基因进而阻断NAFLD进展已成为治疗和新药研发的重点。前期研究已经表明辛温通阳中药葱白提取物能够上调NAFLD大鼠肝细胞内PGC-1α表达，而PGC-1α的上调能影响哪些线粒体代谢关键分子靶点，从而减少肝细胞内脂肪浸润及氧化损伤对揭示葱白提取物治疗NAFLD有重要意义。
1 材料与方法 1.1 动物及细胞系SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠48只，6~8周龄，体质量180~220 g，由湖北省疾病控制中心提供。合格证编号：SCXK（鄂）2008－0005；293T细胞系，购于赛默飞公司。
1.2 药物与试剂葱白提取物来自于华夏小葱根茎，由武汉市第一医院药剂研究室采用超临界二氧化碳萃取工艺提取[6]，为褐色粉末状，批号：20110902，以适量植物油调配成为悬混液，控制浓度为5 g/L；D12492高脂饲料（H10060），含60%能量，购于赛诺公司；由武汉巴菲尔生物有限公司提供空载腺病毒及PGC-1αRNAi腺病毒，PGC-1α RNAi腺病毒滴度：109 pfu/mL。PGC-1α抗体（PA5-22958）、线粒代谢相关蛋白细胞色素c氧化酶B（COX-B）抗体（ab15191）、线粒体转录因子（TFAM）抗体（sc-166965）、细胞色素c氧化酶合成蛋白（SCOX）抗体（sc-98499）、中链酰基辅酶A脱氢酶（MCAD）抗体（sc-98926）、核呼吸因子1（NRF-1）抗体（sc-54134）购于Santa Cruz公司，HRP标记羊抗兔二抗（BA1054）、HRP标记兔抗羊二抗（BA1060）、β-actin抗体（BM0627）购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 主要仪器Sigma30高速低温离心机（法国，Sigma公司），HITACHI7160全自动生化检测仪（日本，HITACHI），微量移液器（Eppendorf公司），电泳仪电源（北京六一仪器厂，DYY-7C），垂直电泳槽（北京六一仪器厂，DYCZ-24DN），电转仪（北京六一仪器厂，DYCZ-40）；水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS-1），pH计（德国Metter-Toledo GmbH公司，LP115），电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，CPA）；P4000高效液相色谱仪（美国TSP公司），二极管陈列检测器（美国TSP公司，UV6000），荧光定量PCR仪（ABI7500，美国Temo公司）。
2 方法 2.1 造模方法48只SD大鼠饲养于武汉市第一医院动物房，昼夜节律12 h∶12 h，即晨6时开灯，晚6时关灯，20~24 ℃，25%相对湿度，自由饮水，适应性饲养7 d后，除外8只空白组大鼠给予维持饲料外，其余40只大鼠给予高脂饲料喂养12周。
2.2 造模后给药高脂饲料喂养12周后结束造模，空白组大鼠继续给予普通饲料持续喂养，另外40只大鼠随机分为模型组、葱白组、转染组、空转组及转染加葱白组，每组各8只，5组大鼠继续给予高脂饲料喂养；空白组大鼠每日生理盐水1 mL腹腔注射和3 mL生理盐水灌胃；葱白组大鼠每日葱白提取物灌胃1次，葱白提取物灌胃计量为50 mg/kg，同时生理盐水1 mL腹腔注射；转染组大鼠每日给予肠系膜上静脉（SMV）皮下置管给药0.05 mg/kg，同时予以3 mL生理盐水灌胃；空转组大鼠每日给予SMV皮下置管注射空载体病毒0.05 mg/kg，同时予以3 mL生理盐水灌胃；转染加葱白组大鼠每日给予SMV皮下置管给药0.05 mg/kg及50 mg/kg葱白提取物灌胃。各组操作固定每日下午，共持续进行4周。
2.3 标本采集药物处理4周后，大鼠禁食不禁水12 h，以3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，静置一段时间，待血液分层后与4 ℃，3 000 r/min离心15 min，离心半径4 cm，分离血清，-80 ℃冻存备用。同时取出肝脏，称质量，用4 ℃生理盐水冲洗，常规进行苏木精-伊红（HE）及红油染色。
2.4 观察指标及方法观察大鼠进食、毛发、粪便、活动量情况。
2.4.1 化学合成的PGC-1α小干扰RNA的构建与应用化学合成的PGC-1α小干扰RNA（SiRNA）参照设计的序列：反义链5’-CCACCTAACTTCAC-CACATCT3-’，正义链5’-AGATGTGGTGAATTTA-GGTGG-3’，将化学合成的PGC-1αsiRNA转染至NAFLD进展期大鼠，采用经SMV皮下置管给药通路。麻醉大鼠后，腹中线切开，显露SMV，将24号穿刺导管针从SMV分支插入。固定后，以硬膜外导管续接引入皮下，外接肝素帽后固定，供siRNA注射用。采用荧光实时定量聚合酶链式反应（Realtime PCR）检测PGC-1α的表达，验证转染成功。
2.4.2 肝组织病理学检查在各组大鼠肝右叶相同处取适量肝组织，于10%甲醛溶液中固定，再经脱水后以石蜡包埋，最后进行HE及红油染色，在光学显微镜下观察肝脏的病理变化。并按照NAFLD活动性评分（NAS评分）标准进行打分[5]。
2.4.3 血清中高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量测定生化检测仪测定各组大鼠血清中HDL-C、LDL-C、TC、TG含量。
2.4.4 RNA的提取和逆转录聚合酶链反应引物设计见表 1，Trizol试剂一步反向引物法抽提肝组织总RNA，紫外分光光度仪检测其浓度及纯度，1%琼脂糖变性电泳检测RNA完整性。用M-MLV逆转录酶进行反转录，PCR扩增上述基因，同时扩增β-actin蛋白作内参照。取6~10 μL扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外投射仪上观察、照相。
取肝组织匀浆，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤离心3次，加蛋白提取液200 μL混匀，沸水煮10~15 min后，12 000 r/min离心30 min，离心半径4 cm，取上清液，测总蛋白浓度，-20 ℃保存备用。配制10%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶，样品加热变性后每孔加80 μg蛋白，电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉4 ℃摇动封闭过夜，膜在一抗中室温下孵育2 h，TBS洗涤，二抗室温2 h。加显色液1 μL，X线底片曝光，显影、定影，并对底片上反应条带行计算机密度扫描定量分析。
2.5 统计学方法使用SPSS 24.0软件对所有数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果 3.1 PGC-1α RNAi腺病毒及空载体腺病毒包装及转染率实验在实验各组大鼠中进行PGC-1α RNAi腺病毒转染验证。结果显示空白组1.12±0.09，模型组0.65±0.03，葱白组1.04±0.07，转染组0.34±0.02，空转组0.66±0.05，转染加葱白组0.71±0.11。和空转组比，转染组PGC-1α mRNA的表达水平明显降低（P＜0.01），证实转染成功。和空白组比，模型组PGC-1α mRNA的表达水平降低（P＜0.01），证实NAFLD发生发展过程与PGC-1α失活相关。和模型组比，葱白组PGC-1α mRNA的表达水平增加（P＜0.01），转染加葱白组差异无统计学意义。见图 1。
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| 注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与空转组比较，△△P＜0.01 图 1 PGC-1αRNAi腺病毒实验各组大鼠肝脏PGC-1α mRNA表达的影响（x±s，n=8） Fig. 1 Effect of PGC-1αRNAi adenovirus on PGC-1α mRNA expression of rat liver in each group (x±s, n=8) |
高脂饲料可显著影响大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平，与空白组比较，模型组NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL-C的表达水平均升高，HDL-C水平下降（P＜0.01）；而葱白提取物可改善高脂饮食对血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影响，与模型组比较，通过葱白提取物灌胃后葱白组大鼠血清TC、TG、LDL-C表达水平均降低，HDL-C水平升高（P＜0.01）；转染组、空转组及转染加葱白组与模型组间的差异无统计学意义，见图 2。
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| 注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。 图 2 实验各组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C浓度比较（mmol/L，x±s，n=8） Fig. 2 Comparison of serum concentrations of TG, TC, HDL-C and LDL-C of rats in each group (mmol/L, x±s, n=8) |
为验证葱白提取物对肝脏脂质合成的影响，我们检测了脂肪酸合成与分解关键限速酶ACCase与CPT-1 mRNA的表达。与空白组相比较，模型组大鼠ACCase mRNA表达升高（P＜0.05），而CPT-1 mRNA表达降低（P＜0.05）；与模型组相比，葱白组ACCase mRNA表达明显降低（P＜0.01），而CPT-1 mRNA表达明显升高（P＜0.01），见图 3。与模型组相比，转染组和转染加葱白组未见明显异常。
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| 注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，##P＜0.01。 图 3 实验各组大鼠肝脏ACCase mRNA、CPT-1mRNA的表达（x±s，n=8） Fig. 3 Expression of ACCase and CPT-1 mRNA of rats in each group(x±s, n=8) |
从肝脏外观来看，空白组大鼠肝脏色泽鲜红，表面光滑，边缘锐利；葱白组接近正常对照组，无明显油腻状，指压有弹性，体积大小接近正常对照组；其余4组大鼠肝脏肉眼观体积增大，颜色浅黄，质软，边缘变钝，表面带油腻感。
从HE染色结果来看，空白组细胞基本无异常变化，未见明显脂滴空泡；模型组，空转组，转染组及转染加葱白组细胞胞浆内充满大小不等的脂滴空泡，部分肝细胞核被挤到一边，细胞肿胀，同时可见用红色箭头标记的炎性细胞浸润；葱白组细胞内脂滴明显少于模型组。
从油红染色结果来看，空白组肝细胞边缘清晰，核大，细胞内未见红色脂滴聚集；模型组，空转组及转染组肝细胞边缘欠清晰，细胞间结合欠紧密，胞浆内充满大小不等的红色脂滴，细胞发生明显的肿胀；葱白组肝细胞内橘红色脂滴明显少于模型组，转染加葱白组肝细胞内红色脂滴介于模型组和葱白组之间。
通过肝细胞气球样变、小叶内炎症及肝细胞脂肪变3方面进行NAS评分，其结果显示与空白组大鼠相比，高脂饮食造成的模型组大鼠的NAS评分显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，经葱白提取物处理后的葱白组大鼠肝脏NAS评分有明显改善（P＜0.01）；空转组，转染组，转染加葱白组未见明显差异。见图 4，图 5。
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| 图 4 实验各组大鼠肝脏组织HE及红油染色 Fig. 4 HE and red oil stain of rat liver tissue of rats in each group |
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| 注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。 图 5 实验各组大鼠肝脏NAS量表评分（x±s，n=8） Fig. 5 NAS scale scores of liver of rats in each group(x±s, n=8) |
细胞凋亡是NAFLD疾病进展的最要标志之一，而肝细胞凋亡的途径主要有两种，即死亡受体通路及线粒体通路[7-8]。因此，本实验研究了葱白提取物对NAFLD大鼠肝脏线粒体合成的影响。在实验各组大鼠中，与空白组比较，模型组大鼠肝脏的PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白的表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，葱白组大鼠肝脏的PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白表达升高（P＜0.01）；与空转组比较，转染了PGC-1αSiRNA的转染组大鼠中PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图 6。
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| 注：A.空白组，B.模型组，C.葱白组，D.空转组，E.转染组，F.转染加葱白组。与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与空转组比较，△P＜0.05。 图 6 大鼠肝脏PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白的表达水平条带图及灰度统计图（x±s，n=8） Fig. 6 Histogram and gray scale statistical map of the levels of PGC -1α, NRF -1, TFAM in rat liver tissue detected by Western Blot(x±s, n=8) |
实验研究表明，线粒体呼吸连中关键限速酶的下降，可导致电子传递的紊乱，致使线粒体的肿胀、凋亡，进而引起“二次打击”[9-12]。因此，本实验对线粒体呼吸链关键分子靶点进行了研究，以验证葱白提取物对其影响。在实验各组大鼠中，与正常组比较，模型组的线粒体代谢功能相关蛋白COX-B、SCOX、MCAD的表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，葱白组的COX-B、SCOX、MCAD蛋白表达升高（P＜0.01）；与空转组比较，转染组的COX-B、SCOX、MCAD蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图 7。
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| 注：A.空白组，B.模型组，C.葱白组，D.空转组，E.转染组，F.转染加葱白组。与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与空转组比较，△P＜0.05。 图 7 大鼠肝脏COX-B、SCOX、MCAD蛋白的表达水平条带图及灰度统计图（x±s，n=8） Fig. 7 Histogram and gray scale statistical map of the levels of COX-B, SCOX, MCAD in rat liver tissue detected by Western Blot(x±s, n=8) |
NAFLD的发病机制虽尚未完全明了，但“二次打击”学说为目前医学界广泛接受。第1次打击是以胰岛素抵抗（IR）为中心的肝内脂肪的蓄积，第2次打击是氧化磷酸化的激活、呼吸链的损伤导致能量代谢障碍、细胞因子活化，从而引起炎症和纤维化[13]。
线粒体的合成和代谢功能的紊乱是NAFLD疾病进展的关键因素之一。线粒体被誉为“人体的化工厂”，在肝细胞线粒体中存在着多种代谢反应，它既是肝细胞三磷酸腺苷（ATP）合成的场所，又是脂肪酸β氧化和肝糖异生的主要场所[14]。线粒体代谢功能失调参与了NAFLD的发生发展。在NAFLD早期，肝糖异生增加与IR密切相关。随着病情进展，可使线粒体超微结构出现了损伤，其呼吸链复合物的量及活性下降，合成ATP的功能障碍。因此，线粒体代谢障碍与胰岛素抵抗，氧应激，脂质过氧化和ATP合成减少等均密切相关，是NAFLD发生发展的关键。保护肝细胞线粒体，提高肝细胞抗氧化能力，阻止过氧化应激反应，对于减少肝脏脂肪沉积并避免因“二次打击”而导致肝功能失代偿具有重要意义[15]。
通过血生化检查，证实葱白提取物能改善NAFLD大鼠血脂水平，可显著降低血清TG、TC、LDL-C浓度，升高血清HDL-C浓度。同时，葱白提取物可降低脂质合成基因ACCase[16]的表达，并升高促进脂肪酸氧化分解基因CPT-1[17]的表达。通过HE染色及红油染色，证实葱白提取物能改善NAFLD大鼠肝脏小叶内炎症、肝细胞气球样变及肝细胞脂肪变。
PGC-1α在肝脏中最重要的作用是通过促进NRF-1和2，雌激素相关受体α（ERRα）以及转录抑制蛋白阴阳1（YY1）的转录来增加肝细胞线粒体生物合成[18-20]。其中，NRFs可通过调节TFAM表达的，TFAM作为线粒体DNA转录因子，可控制线粒体内DNA复制、保存以及表达，虽然ERRα和YY1同样具有上述作用，但任然是NRFs占主导地位[21]；同时，NRFs还可控制编码氧化磷酸化蛋白的核基因的表达[22]。因此，PGC-1α可同时上调线粒体DNA和线粒体DNA编码的蛋白的数量，进而增加脂肪酸氧化、柠檬酸循环和氧化磷酸化的能力。
通过比较模型组与葱白组NRF-1、TFAM蛋白的表达，实验发现葱白提取物是通过上调PGC-1α表达来增加肝细胞线粒体DNA及其编码蛋白的表达，对维持正常的线粒体功能有重要作用。
进一步的研究表明NRF-1，TFAM表达的下降可影响线粒体呼吸链的稳定[23]。线粒体呼吸链是由多种酶所共同构成，如SCOX，COX-B，MCAD[24]。
因此，在本次实验中验证了葱白提取物对线粒体呼吸链稳定性的影响。笔者发现在模型组大鼠中PGC-1α、SCOX、COX-B以及MCAD的表达共同下降，呈正相关性；与模型组大鼠相比，葱白组大鼠在运用葱白提取物后PGC-1α、SCOX、COX-B、MCAD蛋白表达上调，证实葱白提取物可通过上调PGC-1α，增加SCOX、COX-B、MCAD蛋白的表达，进而维持线粒体呼吸链稳定性。
综上所述，通过运用辛温通阳的葱白提取物可诱导PGC-1α的高表达，PGC-1α作为转录辅助因子可促进线粒体的生物合成相关蛋白NRF-1、TFAM上调，而NRF-1、TFAM上调可增加氧化还原反应关键蛋白SCOX、COX-B和MCAD，为维持呼吸链的稳定起到重要作用，使肝细胞维持正常的脂肪酸代谢及糖异生反应，从而减轻TG在肝脏的堆积，可达到治疗脂肪肝变性的目的。
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