血脑屏障（BBB）是脑毛细血管阻止某些物质由血液进入脑组织的结构^[1]。神经元在正常活动时，需要非常稳定的内环境，而这种稳定性的实现，有赖于BBB的存在。研究显示，脑缺血再灌注损伤时，BBB不仅有结构的损伤和改变，也出现功能异常，即通透性改变、转运功能破坏等^[2]。同时，BBB功能性开放又导致外周有害物质的渗入，引起继发性脑损伤^[3]。脑微血管内皮细胞（BMEC）是构成血脑屏障的主要结构^[4]，BMEC一面与血液接触，一面与脑细胞连接，保护神经元免受血液中潜在有害物质的损害，其细胞间的紧密连接是BBB模型的一个重要特征^[5]。目前BMEC体外培养模型已经被广泛应用于BBB的研究。

迷迭香酸（RA）是一种水溶性的天然酚酸类化合物，广泛存在于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科的多种植物中，具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性^[6]。目前，对RA在脑缺血后的保护作用报道较少，尤其在RA维持脑缺血后BBB功能方面尚未见报道。因此，本研究体外原代培养大鼠BMEC，以氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）损伤，模拟在体脑缺血再灌注损伤的BBB模型。通过检测细胞活力、乳酸脱氢（LDH）漏出、跨细胞间电阻（TEER）值，异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖透过，罗丹明123（Rh123）蓄积等指标，明确RA对OGD/R损伤BMEC的保护作用；通过检测紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5和转运蛋白P-gp、MRP1 mRNA表达，证实RA可以维持脑缺血后BBB的功能；通过p-Akt/Akt蛋白表达及抑制剂的应用，初步考察RA对BBB功能影响的可能的上游机制。

1 材料 1.1 药物与试剂

迷迭香酸（RA，质量分数＞98%），上海源叶生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS），北京索莱宝科技有限公司；Ⅱ型胶原酶、胶原酶/分散酶、内皮细胞生长因子（ECGF），Roche公司；CCK-8试剂盒，同仁化学；LDH试剂盒，Promega公司；异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖，Sigma公司；PrimeScript TMRT试剂盒、SYBR^ⓇPremix Ex Taq^TM，TaKaRa公司；p-Akt、Akt抗体，CST公司；β-actin、ZO-1、Claudin-5、P-gp、MRP1引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；LY294002抑制剂，Calbiochem公司。

1.2 动物

Wistar大鼠，20日龄，体质量（40±5）g，雌雄不限，共计购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 仪器

低温离心机，美国Beckman公司，酶标仪，美国，MD公司，PCR扩增仪，美国，Bio-rad公司，实时荧光定量系统，美国，Bio-rad公司，凝胶成像系统，美国，Bio-rad公司。

2 方法 2.1 脑微血管内皮细胞培养

参考文献^[4]，将Wistar大鼠脱颈处死，置于75%乙醇中浸泡3~5 min消毒。取出全脑，置于冷的D-Hank’s液中，去除小脑、间脑、血管、软脑膜等，保留大脑皮质。用眼科剪将脑组织剪成约1 mm³碎片，加入0.7 mg/mL Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化1 h，1 000×g离心10 min，弃上清液，加20% BSA混匀，1 000×g离心20 min，保留底层沉淀。再加入1 mg/mL胶原酶/分散酶，37 ℃消化1 h，700×g离心6 min，弃上清液，DMEM液漂洗2次，加入DMEM全培基（含20% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、30 μg/mL ECGF、100 μg/mL肝素钠）重悬细胞，接种于75 cm²培养瓶中，2 d后换液，单层BMEC融合至70%~80%时传代。用消化液（0.25%胰酶和0.02% EDTA组成）消化，轻轻吹打成细胞悬液，1 000×g离心5 min，弃上清液，加入DMEM全培基重悬，种于培养板中。

2.2 分组及处理

将传代的BMEC密度调至4×10⁵/mL，根据实验需要分别种于96孔板、6孔板及Transwell套筒上，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，每2 d换液1次。待细胞融合时分为5组：对照组（Con），加入全培基，正常孵育24 h；模型组（OGD/R），加入平衡盐溶液，置于95% N₂-5% CO₂条件下缺氧培养6 h后，置换为全培基，正常孵育18 h；RA组，分别加入终浓度2.5、5、10 μmol/L RA的平衡盐溶液，置于95% N2-5% CO₂条件下缺氧培养6 h后，置换含2.5、5、10 μmol/L RA的全培基，正常孵育18 h。抑制剂组，提前给予20 μmol/L LY294002孵育1 h后，处理方法同其他组。

2.3 CCK-8试剂盒检测细胞活力

细胞分组处理后，弃上清液，培养板中每孔加入100 μL含10% CCK-8的DMEM培养液，37 ℃孵育30 min，酶标仪450 nm波长检测各孔吸光度（A）。

2.4 LDH试剂盒检测乳酸脱氢酶漏出量

细胞分组处理后，吸取25 μL的上清液于96孔板中，加入25 μL CytoTox-ONE^TM Reagent，于22 ℃孵育10 min后，加入12.5 μL Stop Buffer，振荡10 s，于激发波长560 nm，发射波长590 nm处检测荧光值。

2.5 跨细胞间电阻的测量

BMEC种于套筒内侧，每天固定时间测定细胞间电阻值，即将电阻仪电极分别插入Transwell小室内外侧，待电阻值达到稳定后可用于实验。细胞分组给药处理后，再测量每组TEER值。

2.6 FITC-葡聚糖通过量的测定

细胞处理24 h后，用D-Hanks洗2遍，Transwell套筒内侧加入1 mg/mL FITC-葡聚糖，外侧加入1.5 mL平衡盐溶液，孵育4 h后，Transwell套筒内外侧分别取液体100 μL，加入到96孔板，酶标仪检测，激发波长为494 nm，发射波长为520 nm，计算FITC-葡聚糖透过量。

2.7 Rh123摄取实验

细胞分组处理后，弃上清液，每孔加入含有终浓度为5 μmol/L的Rh123，37 ℃避光孵育120 min，用冷HEPES溶液终止转运并漂洗细胞3遍后，加入0.2%Triton吹打细胞，细胞裂解后吸取上清液于激发波长485 nm，发射波长530 nm处检测荧光强度。并按照BCA蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白质含量。

2.8 紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5和耐药蛋白P-gp、MRP1 mRNA检测

BMEC接种于6孔培养板中，培养至80%融合，分组加药处理。各组用Trizol提取细胞总RNA，按Two-Step RT-PCR试剂盒说明书反转录合成cDNA。检测ZO-1、Claudin-5、P-gp、MRP1 mRNA表达水平，以β-actin为内参，各基因进行相对定量分析。

2.9 Western blot法检测p-Akt、Akt蛋白表达

BMEC分组加药处理后，弃掉上清液，用预冷D-Hanks洗2遍，加入RIPA裂解液，超声裂解细胞，混悬液低温离心15 min，吸取上清液，蛋白定量、变性。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗p-Akt、Akt，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗免疫球蛋白G（IgG），室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，增强化学发光法显影。采用ImageJ软件分析，记录灰度值，进行定量分析。

2.10 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 RA对OGD/R损伤BMEC细胞活力及LDH漏出量的影响

与Con组相比，OGD/R组BMEC细胞活力明显下降（P < 0.001），LDH漏出量明显升高（P < 0.001），RA在2.5、5、10 μmol/L时能显著升高缺氧损伤BMEC细胞活力（P < 0.05，P < 0.001，P < 0.001），降低LDH漏出量（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）。见表 1。

3.2 RA对OGD/R损伤BMEC TEER值、FITC-葡聚糖透过、Rh123摄取的影响

跨细胞间电阻值是最简单、直观的体现BBB完整性的方法。本研究所培养BMEC细胞在种于套筒内侧7 d后TEER值可达到170~180 Ω/cm²，证明细胞屏障生成，可用于后续实验。OGD/R处理后，TEER值明显降低（P < 0.001），而给予5、10 μmol/L RA后可抵消ODG/R损伤造成的TEER降低（P < 0.01，P < 0.001）。见表 2。

FITC-葡聚糖透过、Rh123摄取实验，是检测BBB屏障功能的常用指标。BMEC在经过OGD/R处理后，FITC-葡聚糖通过率、胞内Rh123蓄积量明显增加（P < 0.001，P < 0.001），而给予5、10 μmol/L RA处理后能降低FITC-葡聚糖透过率（P < 0.05，P < 0.001），给予10 μmol/L RA能降低胞内Rh123蓄积量（P < 0.01），提示RA不仅能维持内皮细胞间的紧密连接，而且能维护内皮细胞的转运功能。见表 2。

3.3 RA对OGD/R损伤BMEC ZO-1、Claudin-5、P-gp和MRP1 mRNA表达的影响

紧密连接是BBB通透性的中心环节，ZO-1、Claudin-5是紧密连接的主要结构蛋白，其表达水平的变化与BMEC通透性的改变程度密切相关。本实验通过Real time RT-PCR法检测OGD/R损伤BMEC紧密连接ZO-1、Claudin-5 mRNA表达，结果显示，OGD/R损伤后，与Con组比较，OGD/R组BMEC中ZO-1、Claudin-5 mRNA表达显著降低（P < 0.001，P < 0.001）；与OGD/R组比较，5、10μmol/L RA能显著增加ZO-1（P < 0.01，P < 0.001）、Claudin-5（P < 0.001，P < 0.001）mRNA表达。见图 1。

BBB的主要功能是阻止外源和有害物质进入脑内，BBB上存在多种转运蛋白，参与物质的吸收和外排。本实验进一步检测RA对转运蛋白P-gp、MRP1 mRNA表达的影响。结果显示，OGD/R损伤后BMEC转运蛋白P-gp、MRP1 mRNA表达显著降低，而给予5、10 μmol/L RA干预可以显著增加P-gp（P < 0.05，P < 0.001）、MRP1（P < 0.05，P < 0.01）mRNA表达。见图 2。

3.4 RA对OGD/R损伤BMEC p-Akt蛋白表达的影响

血脑屏障的生物化学和构象改变可受多条信号通路调节，本研究从与中枢神经系统损伤保护机制密切相关的PI3K/Akt信号通路，考察RA对BBB的调节作用。与Con组相比，OGD/R组BMEC细胞的p-Akt蛋白表达明显降低（P < 0.001），给予5、10 μmol/L RA后能不同程度的升高p-Akt表达（P < 0.001，P < 0.001），提示RA可能通过Akt信号通路发挥BBB的保护作用。见图 3。

3.5 RA通过PI3K/Akt通路调节OGD/R损伤BMEC BBB功能

与Con组相比，OGD/R组BMEC细胞TEER值降低（P < 0.001），FITC透过率、胞内Rh123量增加（P < 0.001，P < 0.001）；与OGD/R组相比，10 μmol/L RA能够显著升高TEER值（P < 0.01），降低FITC透过率、胞内Rh123量（P < 0.01，P < 0.05）；提前给予PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002可以明显拮抗RA对BBB的上述保护作用（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.05）。见图 4。

4 讨论

BBB结构和功能的损害，使BBB通透性增加，影响脑缺血的病理生理过程，两者之间密切相关。脑缺血损伤后，快速保护并维持BBB功能，是预防继发性神经元损伤的关键^[5-6]。RA广泛分布于多种植物中，尤以唇型科和紫草科植物中含量最高，具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性^[7-9]。目前，对RA的神经保护作用多关注于神经退行性疾病的治疗^[10-11]，对脑缺血后神经系统的作用，尤其是对BBB的影响尚未见报道。查阅文献不难发现，丹参水溶性成分可以维持脑缺血后BBB稳定性，增强紧密连接蛋白表达^[12]。因此，推测RA作为丹参中重要的水溶性成分，可能对BBB具有一定保护作用，其可能是丹参水溶性成分发挥BBB保护作用的物质基础之一。本研究利用原代培养大鼠BMEC细胞，建立体外BBB模型，考察RA对缺血缺氧损伤BBB功能的保护作用及机制。结果发现，RA可以显著逆转OGD/R诱导的BMEC TEER值降低，FITC-葡聚糖透过率增加，胞内Rh123蓄积，证实RA对BBB功能具有保护作用。

BBB的功能指通过其特有的紧密连接结构和多种药物外排转运体表达，以达到限制外周物质进入脑内，保持脑内环境稳态的作用^[13]。跨膜蛋白，胞质附着蛋白及细胞骨架蛋白共同组成紧密连接，各种信号通路通过调控这些蛋白达到对BBB的调节^[14]。ZO-1蛋白是胞质附着蛋白，将跨膜蛋白和细胞骨架蛋白连接在一起，并能识别紧密连接位置及传递各种信号，是紧密连接支持结构的基础，ZO-1缺失会导致紧密连接结构的破坏^[15]。Claudins是组成紧密连接的跨膜蛋白，其种类的组成直接决定BBB的功能^[16]。研究表明，在脑缺血后，BBB通透性的改变与其紧密连接蛋白Claudin-5密切关联^[17]。脑缺血损伤后，脑毛细血管内皮细胞不仅紧密连接蛋白被破坏，同时转运蛋白亦受影响。转运蛋白能识别特定分子，使糖类、氨基酸类等营养物质顺利通过到达脑内，同时阻止外源和有害物质进入脑内，以维持神经系统内环境的相对稳定^[18-19]。P-gp和MRP1是脑毛细血管内皮细胞膜上重要的转运蛋白，P-gp主要存在于脑毛细血管内皮的管腔侧，可将其底物从脑中外排到血液中，从而限制了这些物质向脑内的转运^[20]。MRP家族主要介导多种有机阴离子的外排转运，如氧化谷胱甘肽等。研究发现，小鼠经大脑中动脉闭塞（MCAO）处理^[21]，或体外内皮细胞经OGD处理后^[22]，脑内皮细胞P-gp、MRP1转录水平均呈下调状态。且MRP1缺陷小鼠表现出更大的脑卒中病变，提示转录蛋白是预防中风的保护因子，具有神经保护作用^[23]。本研究在评价RA对BBB通透性及转运能力的基础上，对紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5和转运蛋白P-gp、MRP1的mRNA表达进行考察，进一步证实RA可以影响BBB紧密连接蛋白及转运蛋白的表达。韦立群发现，RA衍生物能有效下调MCF-7/ADM细胞中多药耐药基因的表达水平，从而降低MCF-7/ADM的耐药性诱导其凋亡^[24]。这似乎与本研究结果相反，究其原因是由于实验目的并不相同，这也正体现中药对不同疾病的广泛应用。

PI3K/Akt通路是由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）始动的生物信号转导通路，近来发现与中枢神经系统损伤的保护机制密切相关。研究显示，脑缺血损伤后，诱导激活PI3K/Akt信号通路，可对神经凋亡产生抑制作用，促进干细胞增殖，发挥神经保护作用^[25-26]。外源性药物通过PI3K/Akt信号通路可减轻脑损伤大鼠的神经炎症和BBB破坏，改善神经功能缺损^[27]。本研究结果发现，OGD/R损伤后，BMEC细胞Akt表达水平明显降低，给予RA后可以显著升高Akt表达。提前给予抑制剂LY29004，可以明显拮抗RA对BMEC细胞的通透性及转运功能，进一步证实了RA发挥BBB保护作用与PI3K/Akt信号通路相关。

基于以上结果提示，RA对缺氧/复氧诱导的体外BBB功能具有保护作用，可以影响脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白、转运蛋白表达，其机制可能与促进PI3K/Akt信号激活有关。这一结果为RA在神经保护方面的进一步研究提供了实验基础。