溃疡性结肠炎（UC）是一种肠道非特异性炎性疾病，发病多与遗传、环境及免疫反应异常有关，病因和发病机制至今尚未被完全阐明^[1]。UC临床表现为腹痛腹泻和黏液脓血便，常反复发作^[2]。目前普遍认为UC是结直肠癌发生发展的重要危险因素^[3-4]。近年来，越来越多的研究表明，中医药在缓解UC患者的病情、改善生活质量、减少毒副作用等方面有明显优势^[5-6]。

当归汤为中医治疗结肠炎的经典方，首载于《外台秘要·卷第二十五·数十年痢方一十一首》，文中记载“当归汤，疗三十年下痢，止诸痛方”^[7]。当归汤由当归、大枣、生姜组成，3药合用，温中止泻、补脾益气、和血止痛，且现代药理学研究表明，3药对UC具有改善作用^[8-10]。多糖类成分是当归汤中的主要化学成分，且具有抗炎抗氧化、调节免疫等药理作用^[11-12]，其是否是改善UC的有效物质有待研究。

RAW264.7细胞和脾细胞是免疫相关的药物活性评价常用细胞模型^[13]。TNBS模型于1984年由Morris等首次成功建立^[14]，该法操作简单，持续时间长且组织学变化与人类UC相似，是目前常用的UC模型之一^[15]。因此，文章旨在通过体内外药理学研究手段，探讨当归汤多糖对UC的作用及其机制，以期为UC的药物研发和临床治疗提供一定的实验依据。

1 材料 1.1 药品及试剂

红细胞裂解液、青链霉素（北京索莱宝科技有限公司）；RPMI 1640培养基、高糖DMEM培养基、刀豆蛋白A（Con-A，美国Corning公司）；大鼠白细胞介素（IL）-2、干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（美国Raybiotech公司）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries公司）；脂多糖（LPS）、二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；NO检测试剂盒（北京拜尔迪生物技术有限公司）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，P2297-10 mL，美国Sigma-Aldrich公司）；艾迪莎美沙拉秦缓释颗粒（中国上海爱的发制药有限公司，批号：1810106）；髓过氧化物酶（MPO）试剂盒（A044-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（WST-1法，A001-3-2）、丙二醛（MDA）试剂盒（A003-1-2，南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白含量检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；其余试剂为分析纯。

1.2 实验动物及细胞

SPF级雄性SD大鼠（体质量180~200 g），购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002。实验动物饲养于北京中医药大学动物实验中心，温度为（25±2）℃，湿度50%±10%，12 h循环光照。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心）。

1.3 实验仪器

BJ-2CD型净化工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；311型二氧化碳培养箱、ST8R高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；SPECTROstar Nano全波长酶标仪（德国BMG LABTECH公司）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；TS2-S-SM光学显微镜（日本尼康公司）；80-2型离心机（巩义市科瑞仪器有限公司）。

2 方法 2.1 当归汤多糖的提取

采用实验室前期优化的提取工艺制备：30倍量水回流提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.15~1.20（60 ℃），加乙醇使醇浓度为70%，冷藏12 h，4 000 r/min离心15 min（r=7.9 cm，下同），取沉淀，干燥备用。经苯酚-硫酸法检测，当归汤多糖含量为（634.79±3.10）mg/g。

2.2 动物实验 2.2.1 模型建立与实验分组

36只SD大鼠适应性饲养后，随机分为6组，对照组（Control）、模型组（TNBS）、美沙拉嗪组（Mesalazine）、当归汤多糖低剂量组、中剂量组和高剂量组。采用TNBS单次灌肠法制备大鼠UC模型：SD大鼠10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，取石蜡润滑的灌胃针插入肛门约8 cm，灌注TNBS溶液，灌肠后倒立3 min，对照组采用相同操作方法灌注生理盐水。造模第2天开始给药，连续给药7 d。美沙拉嗪组灌胃美沙拉嗪（400 mg/kg），当归汤多糖低、中、高剂量组灌胃给药的剂量分别为0.5、1、2 g/kg，对照组与模型组均灌胃去离子水。实验结束后，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，取脾脏置于无菌PBS缓冲液中备用；取出肛门至盲肠末端的整个肠段，测量长度；沿纵轴剖开结直肠，观察大体形态并进行评分；结直肠组织分段后部分用10%中性福尔马林固定液固定，其余置于-80 ℃保存，用于后续指标检测。

2.2.2 一般状态观察与疾病活动指数（DAI）

实验期间，每天对大鼠的一般情况进行观察，包括体质量、大便性状与便血情况，进行DAI评分，评分标准参考文献[16]标准。

2.2.3 结直肠宏观损伤评分

沿纵轴剪开结直肠，冰生理盐水洗净后，立即肉眼观察结直肠组织大体形态，并进行宏观损伤评分，评分标准参考文献[17]标准。

2.2.4 苏木精-伊红（HE）染色及结直肠组织病理学分析

取结直肠组织固定于10%中性福尔马林固定液中，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察结直肠组织的病理变化，进行组织病理学评分，评分标准参考^[18]的标准。

2.2.5 氧化应激指标的测定

取结直肠组织加入生理盐水制备组织匀浆，使用BCA试剂盒测量组织匀浆蛋白浓度，参照试剂盒说明书检测并计算结直肠组织中SOD活力、MDA含量和MPO活力。

2.2.6 Con-A刺激下脾细胞增殖检测及IL-2与IFN-γ的测定

脾细胞悬液按2.4.1项下方法制备，将各组大鼠的脾细胞悬浮于RPMI1640完全培养基中，在37 ℃、5% CO₂条件下培养2 h后，除去贴壁细胞，台盼蓝染色计数后以5×10⁵个/mL的密度接种于96孔板中，每孔加入Con-A使终浓度为5 μg/mL刺激细胞，孵育24 h。同时设置不加Con-A的对照组。收集每孔的细胞悬液，1 000 r/min离心3 min，收集上清液用于细胞因子IL-2和IFN-γ检测，细胞重新添加含MTT的培养基，继续培养4 h。1 000 r/min离心3 min，弃去上清液，加入150 μL DMSO，振摇溶解后，转移至96孔板中，550 nm处测量OD值，按公式1计算刺激指数。取与Con-A共孵育24 h的脾细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中的IL-2和IFN-γ。

公式1

2.3 当归汤多糖对RAW264.7细胞一氧化氮（NO）生成的影响 2.3.1 细胞存活率检测

取对数生长期的RAW264.7细胞以1×10⁵个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h后，弃上清液，加入不同浓度（50、100、200、400、800 μg/mL）当归汤多糖的DMEM培养基，每组设置5个复孔。设置溶剂对照组（0.5%DMSO的培养基）和空白对照组。继续培养24 h，避光条件下每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），培养4 h，弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，摇床摇晃10 min，酶标仪490 nm处测量OD值，按公式2计算细胞存活率（%）。

公式2

2.3.2 NO测定

取对数生长期的RAW264.7细胞以1×10⁵个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h后，弃上清液，加入不同浓度（50、100、200、400、800 μg/mL）当归汤多糖的DMEM培养基，每组3个复孔。设置空白对照组和阳性对照组（1 μg/mL LPS刺激）。培养24 h。收集细胞上清液，按NO试剂盒测定方法检测，计算NO抑制率（%）。

2.4 当归汤多糖对Con-A刺激下正常和UC大鼠脾细胞增殖的影响 2.4.1 脾细胞悬液的制备

采用如下方法制备^[19]：牺牲SD大鼠，无菌条件下取脾脏，用RPMI1640培养基漂洗后，采用200目筛网研磨制备组织匀浆，经红细胞裂解液裂解并用PBS清洗后，RPMI1640培养液重悬，37 ℃、5% CO₂条件下培养2 h后除去贴壁细胞，即得脾细胞悬液，使用台盼蓝染色，活细胞数高于95%方可用于后续实验。

UC大鼠脾细胞：造模方法同2.2.1，造模后饲养7 d，期间自由饮水摄食。大鼠牺牲后，脾细胞悬液的制备方法同上。

2.4.2 当归汤多糖给药范围筛选

取按2.3.1项下制备的脾细胞悬液，以5×10⁶个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，加入不同浓度（50、100、200、400、800 μg/mL）当归汤多糖的RPMI1640培养基，每组设置6个复孔，给药后培养48 h。并设置空白对照组。收集每孔的细胞悬液，以1 000 r/min离心3 min，弃去上清液，细胞重新添加含MTT的RPMI1640培养基，继续培养4 h。再次以1 000 r/min离心3 min，弃去上清液，加入150 μL DMSO，振摇溶解后，转移至96孔板中，在550 nm处测量OD值，计算细胞存活率（%）。

2.4.3 Con-A刺激下的脾细胞增殖检测

取按2.4.1项下制备的脾细胞悬液，以5×10⁶个/mL接种于96孔板，每孔100 μL。每孔加入Con-A使终浓度为5 μg/mL。加入不同浓度（200、400、800 μg/mL）当归汤多糖的RPMI1640培养基，每组设置6个复孔，给药后培养48 h。同时设置仅加Con-A的模型组（Con-A组）。检测方法同2.4.2。当给药组OD大于模型组时按公式3计算；当给药组OD小于模型组时按公式4计算。

公式3

公式4

2.5 统计学方法

使用Graphpad 6.0进行分极及绘图，实验数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间多重比较采用Dunnett检验。P < 0.05被认为具有统计学意义。

3 实验结果 3.1 当归汤多糖对TNBS诱导的UC大鼠模型的干预研究 3.1.1 大鼠体质量及DAI评分

实验期间的体质量变化与对照组相比，模型组体质量明显下降。经当归汤多糖治疗后，大鼠体质量逐渐升高。见图 1。实验第8天，与对照组相比，模型组DAI评分显著升高；与模型组相比，美沙拉嗪组与当归汤多糖高剂量组的DAI评分显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表 1。

3.1.2 大鼠结直肠长度与宏观损伤评分

与对照组相比，模型组大鼠结直肠显著缩短（P < 0.01）。与模型组相比，美沙拉嗪组大鼠的结直肠长度显著增加（P < 0.01）。当归汤多糖低、中、高剂量组大鼠的结直肠长度虽然有所恢复，但差异无统计学意义。

宏观损伤评分结果中，对照组大鼠的结直肠形态完好，可见清晰纹理，肠壁厚度均匀，无肉眼可见溃疡和坏死。模型组大鼠的结直肠有水肿和充血现象，肠壁明显增厚，有大面积溃疡和黑色坏死。与对照组相比，模型组的宏观评分显著升高。与模型组相比，美沙拉嗪组和当归汤多糖高剂量组大鼠的宏观评分显著降低（P < 0.01）。见表 2。

3.1.3 大鼠结直肠组织病理学分析

对照组大鼠的结直肠组织结构完整，细胞及腺体排列有序。模型组大鼠结肠结构紊乱，腺体受到破坏，炎症细胞浸润明显，与对照组相比，组织病理学评分显著提高。美沙拉嗪组和当归汤多糖中、高剂量组大鼠结直肠上皮组织较模型组显著改善，组织病理学评分显著降低（P < 0.01）。见图 2、表 2。

3.1.4 大鼠结直肠组织氧化应激指标

与对照组比较，模型组大鼠结直肠组织SOD活力显著减弱，MDA含量明显升高，MPO活力显著增强（P < 0.01）。与模型组相比，美沙拉嗪组和当归汤多糖高剂量组SOD活力均显著增强（P < 0.01）；与模型组相比，美沙拉嗪组和当归汤多糖低、中、高剂量组MDA含量显著下降（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组相比，美沙拉嗪组和当归汤多糖中、高剂量组MPO活力显著减弱（P < 0.05）。见表 3。

3.1.5 Con-A刺激下大鼠脾细胞刺激指数与IL-2、IFN-γ水平

与对照组比较，模型组脾细胞刺激指数显著升高（P < 0.01）。各给药组脾细胞刺激指数与模型组相比显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表 4。采用ELISA法检测Con-A刺激下脾细胞上清液中免疫相关细胞因子IL-2和IFN-γ。与对照组相比，模型组IL-2和IFN-γ浓度显著升高（P < 0.01）；当归汤多糖能够剂量依赖地抑制IL-2和IFN-γ生成，与模型组相比差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表 4。

3.2 当归汤多糖对RAW264.7细胞NO生成的影响 3.2.1 当归汤多糖对RAW264.7细胞活力的影响

当归汤多糖在0~800 μg/mL范围内对RAW264.7细胞的增殖无明显抑制作用，说明在实验浓度下没有细胞毒性，可以用于后续研究。见表 5。

3.2.2 当归汤多糖对RAW264.7细胞NO产生的影响

随着当归汤多糖浓度的增大，RAW264.7细胞的NO水平剂量依赖性地增加，但显著低于阳性对照组（P < 0.01）。见表 5。

3.3 当归汤多糖对Con-A刺激下正常和UC大鼠脾细胞增殖的影响 3.3.1 当归汤多糖给药浓度范围

当归汤多糖在0~800 μg/mL范围内对正常和UC大鼠脾细胞的增殖没有明显抑制作用，说明在实验浓度下没有细胞毒性，可以用于后续研究。见表 6。

3.3.2 当归汤多糖对Con-A刺激下脾细胞增殖的影响

当归汤多糖对Con-A刺激下正常大鼠脾细胞增殖具有明显促进作用，表现出剂量依赖性，浓度为800 μg/mL时增殖率为51.40%±2.56%；对Con-A刺激下UC大鼠的脾细胞增殖表现出轻微的抑制作用，浓度为800 μg/mL时抑制率为16.60%±1.59%。见表 7、8。

4 讨论

临床上常采用控制炎症，抑制自身免疫反应，改善肠道粘膜屏障等措施治疗UC。研究表明，中药多糖治疗UC可能的作用机制有调节免疫失衡、修复肠黏膜损伤、改善肠道菌群失调、抗氧化和抗炎等^[20]。

多糖普遍具有调节免疫的作用。NO由受外界刺激而活化的巨噬细胞所分泌，参与免疫调节，能够杀伤肿瘤细胞、微生物等，起到保护机体的作用^[21]。当归汤多糖能够剂量依赖地促进RAW264.7细胞释放NO，同时NO水平低于阳性对照组，提示当归汤多糖具有温和的免疫调节能力，适宜作为免疫调节剂^[22]。同时，当归汤多糖能够促进Con-A刺激下正常大鼠脾细胞增殖，抑制Con-A刺激下TNBS诱导的UC大鼠的脾细胞增殖，在一定程度上体现了当归汤多糖双向免疫调节能力。通过动物实验发现模型组大鼠Con-A刺激下脾细胞刺激指数显著高于其他组，且Th1免疫应答相关细胞因子IL-2和IFN-γ呈现高表达，表明TNBS诱导的UC大鼠免疫异常^[23]。当归汤多糖能够剂量依赖地抑制Con-A刺激下的脾细胞增殖、IL-2和IFN-γ产生，表明对于TNBS诱导UC大鼠，当归汤多糖可能通过调节异常的免疫应答从而达到改善作用。

氧化应激反应是UC发病的另一个重要因素，MDA、SOD和MPO是反映氧化应激水平的重要指标。UC会产生大量的氧自由基，致脂质过氧化，产生大量MDA，其含量升高会引起细胞毒性，MDA水平能够反映氧化损伤程度^[24]。当体内氧自由基增多时，可产生SOD清除氧自由基，所以，SOD活性间接反映组织损伤程度^[25]。氧化应激会导致中性粒细胞浸润，中性粒细胞浸润是UC最突出的组织学特征之一^[26]，MPO是富含于中性粒细胞中的一种血红素蛋白，外界刺激下中性粒细胞聚集释放MPO，因此MPO活性可用于评估中性粒细胞浸润程度，从而间接反映氧化应激和炎症性肠病的严重程度^[27]。本研究显示，给予高剂量的当归汤多糖，UC大鼠MDA含量和MPO活力降低，SOD活力升高，表明当归汤多糖可以抑制UC大鼠氧化应激，从而改善UC。

综上所述，当归汤多糖对TNBS诱导的大鼠UC具有改善作用，其作用机制可能与免疫调节，抗氧化有关。