地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera（Michaelsen）的干燥全体^[1]，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效^[2]。其中参环毛蚓由于加工精细且临床疗效确切而被公认为品质最佳^[3]。近年来，由于地龙品种较多，相近物种地龙形态较为相似，导致市场上流通的地龙品种十分混乱^[4]。

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新型的等温核酸扩增技术^[5]，该技术针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在恒温条件下即可在30~60 min内完成10⁹~10¹⁰倍靶序列拷贝^[6]。马梅等^[7]研究表明地龙正品与其混淆品种间COI基因序列均存在较多变异位点，因此本研究针对参环毛蚓COI基因序列设计LAMP引物，结合荧光染料法对参环毛蚓进行检测，为地龙中药材的现场鉴别提供技术支撑。

1 材料与仪器 1.1 地龙样品

收集29份地龙样品，主要采自广西、上海、海南地区，凭证标本保存于天津中医药大学中医药研究院，见表 1。

1.2 仪器

SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司）；DYY-8C型核酸电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；ZHJH-C1112B型超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；聚合酶链式反应仪（Eppendorf）；ZF-6型紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；JA3003型电子精密天平（天津天马衡基仪器有限公司）。

1.3 试剂

Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶（NEB公司，批号M0538S）；TksGflex DNA聚合酶（TaKaRa，批号R060A）；琼脂糖（LONZA，批号50002）；无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）；6×Loading Buffer（TaKaRa，批号9156）；10000×SYBR Green I核酸染料（Solarbio，货号SY1020）；Du Red（北京泛博生物化学有限公司）；D2000 DNA Marker（TIANGEN，批号MD114）；无酶水（Biosharp）。

2 实验方法 2.1 基因组总DNA提取及PCR扩增、一代测序

剪取29份地龙样品肌肉组织约30 mg，放入洁净的1.5 mL EP管中，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）说明书提取总DNA，取5 μL提取产物，加入1 μL 6 × Loading buffer混匀后于Du Red染色的1%琼脂糖凝胶电泳，判断DNA提取质量及长度。选择通用引物COI对所提取DNA进行扩增，25 μL反应体系包括12.5 μL 2×Gflex PCR Buffer，0.5 μL 10 μmol/L LCO1490（10 μmol/L），0.5 μL 10 μmol/L HCO2198（10 μmol/L），0.5 μL DNA模板，1.25 U TksGflex DNA Polymerase，10.5 μL无酶水。引物序列及扩增程序见表 2，PCR反应在PCR仪上进行。扩增结束后取5 μL扩增产物，加入1 μL 6 × Loading buffer混匀后于Du Red染色的1%琼脂糖凝胶电泳，选择阳性PCR产物样品进行一代双端测序。

2.2 LAMP引物设计与合成

利用GenBank数据库中钜蚓科动物的线粒体COI序列，使用Geneious 8.0.4去除引物区，利用MAFFT v7.271进行序列比对，筛选参环毛蚓特有的变异位点，针对其变异位点在网站（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）设计LAMP引物。挑选3组引物组于Oligo 7进行引物评价，筛选引物质量最佳的1组引物作为本次实验所用引物组。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表 2。

2.3 LAMP法检测中药材参环毛蚓方法的建立

选取编号为DL-1、DL-2、DL-3、DL-4 4份地龙样品对所设计LAMP引物特异性进行验证。配置反应体系为25 μL包括：0.2 μmol/L dl-F3（10 μmol/L）、0.2 μmol/L dl-B3（10 μmol/L）、1.6 μmol/L dl-FIP（10 μmol/L）、1.6 μmol/L dl-BIP（10 μmol/L）、1×等温扩增反应缓冲液、8 U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、6 mmol/L MgSO₄（100 mmol/L）、1.4 mmol/L dNTPs（10 mmol/L）、1 μL DNA模板、加无酶水补充至总体积为25 μL。LAMP反应程序见表 2。反应结束后取5 μL扩增产物于含Du Red的1%琼脂糖凝胶上电泳，110 V电压，电泳30 min。在余下20 μL扩增产物中加入0.2 μL 10 000×SYBR Green Ⅰ，在自然灯下及254 nm紫外光下观察颜色变化。

2.4 参环毛蚓LAMP扩增灵敏度考察

随机选取1条经分子鉴定为参环毛蚓样品（DL-1）进行灵敏度考察，分别以参环毛蚓DNA原液（约400 ng/μL）、1:10、1:100、1:1 000、1:10 000、1:100 000稀释液为模板，按上述步骤进行LAMP扩增，另设置一阴性对照。

2.5 参环毛蚓LAMP扩增反应时间优化

选取1条经分子鉴定为参环毛蚓样品（DL-1）进行反应时间的优化，分别以0、10、20、30、40、50、60 min反应时间按上述步骤进行LAMP扩增，另设置一阴性对照。

2.6 剩余25份地龙样品LAMP检测

将编号DL-5~DL-29共25份地龙样品按上述步骤进行LAMP扩增，反应时间为50 min，以进一步验证引物特异性。

3 结果 3.1 测序结果

将测序结果于GenBank数据库比对，确定各样品物种，见表 1。

3.2 LAMP特异性检测结果

编号DL-1、DL-2、DL-3、DL-4的4份地龙样品特异性检测结果见图 1。扩增产物于含Du Red的1%琼脂糖凝胶上电泳，结果如图 1-A，参环毛蚓均扩增出梯状条带（阳性），对照组无条带产生（阴性）；在余下20 μL扩增产物中加入0.2 μL 10 000×SYBR Green Ⅰ，在自然灯下观察结果如图 1-B，参环毛蚓在自然光下变为绿色（阳性），保宁环毛蚓、通俗腔蚓、秉氏远盲蚓、空白对照、阴性对照均呈橙黄色（阴性）；将加入了0.2 μL 10 000×SYBR Green Ⅰ的扩增产物置于254 nm紫外灯下观察结果如图 1-C，参环毛蚓在紫外光下呈绿色荧光（阳性），对照组均无荧光产生（阴性）。以上结果表明，所设计的LAMP引物能对参环毛蚓进行特异性扩增。

3.3 参环毛蚓LAMP扩增灵敏度考察结果

灵敏度考察结果见图 2，当稀释10 000倍（约40 fg）时依然可见隐约扩增条带，稀释100 000倍（约4 fg）时无条带产生，证明参环毛蚓LAMP反应灵敏度较高，微量DNA即可扩增出条带。

3.4 参环毛蚓LAMP扩增反应时间优化结果

参环毛蚓LAMP扩增反应时间优化结果见图 3，发现反应时间在30 min时即有条带产生，反应在50 min及60 min时条带最亮。

3.5 剩余25份地龙样品LAMP检测结果

剩余25份地龙样品LAMP检测结果见图 4。扩增产物于含Du Red核酸染料的1%琼脂糖凝胶上电泳，结果见图 4A。编号DL-5、DL-6、DL-9、DL-10、DL-11、DL-14、DL-16、DL-17、DL-18、DL-21、DL-22、DL-23、DL-24、DL-26、DL-29样品均呈阳性梯状条带，其他均呈阴性；在余下20 μL扩增产物中加入0.2 μL 10 000×SYBR Green Ⅰ，在自然灯下观察结果见图 4B。编号DL-5、DL-6、DL-9、DL-10、DL-11、DL-14、DL-16、DL-17、DL-18、DL-21、DL-22、DL-23、DL-24、DL-26、DL-29样品在自然光下变为绿色，其他均呈阴性橙黄色。将加入了0.2 μL 10 000×SYBR Green Ⅰ的扩增产物置于254 nm紫外灯下观察结果见图 4C。编号DL-5、DL-6、DL-9、DL-10、DL-11、DL-14、DL-16、DL-17、DL-18、DL-21、DL-22、DL-23、DL-24、DL-26、DL-29样品在紫外光下呈绿色荧光，其他均无荧光产生。3种检测方式中呈阳性结果样品与表 2中分子鉴定结果为参环毛蚓样品一致。以上结果表明，所设计的LAMP引物能对参环毛蚓进行特异性扩增。

4 讨论

研究表明，参环毛蚓中药材常存在由于雄孔性状特征等不明显而导致难以准确鉴别的状况，不利于该中药的现场快速鉴别。因此需开发新的鉴别方法用以弥补传统方法的不足。

本研究对参环毛蚓LAMP反应灵敏度进行了考察，发现其检出限达40 fg/μL，具有极高的灵敏度。对反应时间的优化结果表明，利用LAMP技术30 min即可完成对参环毛蚓的快速检测，操作简便。因此，本研究利用LAMP技术，无需具有专业知识人士即可实现参环毛蚓的快速鉴别，且不受样品完整性及加工状态等影响，为该动物药的准确鉴定提供了新的方法。