射血分数保留性心力衰竭（HFpEF）是一个与年龄、高血压病、糖尿病、血脂代谢异常等多种危险因素和临床疾病相关的复杂临床综合征，发病率逐年上升^[1]，病死率与射血分数减低性心力衰竭（HFrEF）相似^[2]。传统药物血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂等不能改善HFpEF患者的预后及降低病死率^[3]。目前临床尚无对症的药物应用于HFpEF的治疗。中医认为心力衰竭属于本虚标实之证，HFpEF及HFrEF同属于“气虚血瘀水停”的病机范畴，课题组基于前期研究认为HFpEF主要是水饮之邪盛，阳气被遏，所致气化不利，其气虚程度较HFrEF轻。气化学说源于《黄帝内经》，经张仲景创立，本研究苓桂气化方是课题组应用气化学说具体运用的体现。

前期有报道苓桂术甘汤可提高心力衰竭患者左室射血分数、减小左室舒张末期内径、增加患者6 min步行距离^[4]，近年来，也有部分学者发现苓桂术甘汤对HFpEF也有较好的治疗效果^[5]。课题组通过回顾性研究发现苓桂术甘汤治疗HFpEF最常见的临床配伍是加活血药，以赤芍为代表。苓桂气化方即是由茯苓、桂枝、白术、赤芍4味药物组成，通过调畅三焦，助阳化气，使饮消瘀散。在此基础上，本研究观察其防治HFpEF的药理作用，并通过糖脂代谢、胰岛素抵抗等多方面观察中药干预的作用靶点，旨在为HFpEF的临床防治工作提供更多药理学依据。

1 材料及方法 1.1 实验动物

自发性高血压大鼠（SHR），雌雄各半，SPF级，60只，14周龄，体质量180~260 g，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。相同遗传背景的Wistar Kyoto（WKY）种大鼠，雌雄各半，SPF级，10只，14周龄，体质量180~260 g，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

屏障级动物室饲养，定时给予全价营养饲料喂食，大鼠维持饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，生产合格证：京饲证（2014）06054。室温22~25 ℃，湿度50%~70%，光照12 h，黑暗12 h，适应饲养1周后进行实验。高脂高糖饲料（10%猪油、10%蔗糖、2.0%胆固醇、0.5%胆盐、77.5%基础饲料）的制作由北京科澳协力饲料有限公司完成，生产合格证：京饲证（2014）06054。

1.2 实验药物与试剂

苓桂气化方由茯苓、桂枝、白术和赤芍组成，浸膏，含生药2.28 g/g，由中国中医科学院西苑医院制剂室提供。沙库巴曲颉沙坦钠片（商品名：诺欣妥），50 mg/片，批号：H20170344，由Novartis Pharma Schweiz AG（瑞士）制药公司生产。

链脲佐菌素[STZ，S0130，Merck Millipore（德国）公司生产]，血糖（GLU）试剂盒（批号814253），高密度脂蛋白（HDL-C）试剂盒（批号384041），低密度脂蛋白（LDL-C）试剂盒（批号372984），三酰甘油（TG）试剂盒（批号442499），总胆固醇（TCHO）试剂盒（批号439074），以上试剂盒均由罗氏（上海）诊断有限公司提供。

糖化血清蛋白（GSP）试剂盒（批号20191012），胰岛素（INS）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（批号20191120），胰高血糖素（PG）ELISA试剂盒（批号20191015），C肽（C-P）ELISA试剂盒（批号20191015），瘦素（LEP）ELISA试剂盒（批号20191018），以上试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。心钠素（ANP）ELISA试剂盒（批号20190915），B型脑尿钠肽（BNP）ELISA试剂盒（批号20190915），由北京欣博盛生物技术有限公司提供。

1.3 实验仪器

HDI 5000型，M型超声心动图超声诊断仪[高频线阵，7~15 MHz，飞利浦（中国）投资有限公司]，CL15-7型，超声探头[飞利浦（中国）投资有限公司]，ROCHE/E601型，全自动生化分析仪[罗氏（瑞士）仪器有限公司生产]，DR-200BS型，全自动酶标分析仪（无锡华卫德朗仪器有限公司），T18 Basic型，高速分散器（德国IKA公司），3-18K型，高速低温离心机（美国SIGMA公司），DpxView Pro型，显微彩色图象处理系统（丹麦DeltaPix公司），快速血糖（ACCU-CHEK罗康全活力型血糖仪[罗氏（Roche德国）诊断有限公司]。

1.4 实验方法 1.4.1 大鼠HFpEF模型的制作

50只SHR大鼠持续高脂高糖饲料喂养2周后，腹腔注射STZ（25 mg/kg体质量），72 h血糖可稳定升高，并伴有三多症状，制作糖尿病模型，快速血糖（ACCU-CHEK罗康全活力型血糖仪，罗氏/Roche（德国）诊断有限公司生产）检测在11.1 mmol/L以上可作为糖尿病成功模型选用。造模时STZ应新鲜配制，血糖值升高不符合要求的动物应剔除。高脂饮食诱导加低剂量STZ建立HFpEF心力衰竭大鼠模型^[6-7]，高脂高糖饲料（10%猪油、10%蔗糖、2.0%胆固醇、0.5%胆盐、77.5%基础饲料）喂食诱发胰岛素抵抗^[8]。

糖尿病、血压升高、血脂升高等均为HFpEF的危险因素。研究发现，复合动物模型更能贴近临床，从而模拟临床疾病的发病过程。SHR大鼠是目前公认最接近人类原发性高血压病的动物模型^[9]，也是建立HFpEF的常用模型，16周龄的SHR大鼠即可以出现高血压病的相关并发症，同时其心脏结构的改变也能在心脏超声上有所体现^[6-7]。Zucker自发性高血压肥胖大鼠是雄性自发性高血压心力衰竭大鼠和雌性肥胖糖尿病大鼠的杂交后代，其从10周龄开始出现高血压和左室肥厚，14~18周龄即可出现严重的舒张功能障碍，左房增大，20周龄则表现为HFpEF及肺淤血^[10]。高糖高脂饲料喂养6周，负荷小剂量STZ腹腔注射，再继续喂养6周即可出现HFpEF的病理特点^[7]。课题组前期预实验制作了负荷高压高脂、糖尿病的HFpEF大鼠模型，其超声表现复合HFpEF的病理特点，且负荷模型明显缩短了造模时间。

1.4.2 模型大鼠分组

HFpEF模型存活大鼠，随机分为SHR糖尿病模型组（HFpEF组，注射STZ），阳性药物对照组（诺欣妥组，沙库巴曲颉沙坦钠片18 mg/kg体质量，下同），苓桂气化方低剂量组（苓桂低剂量组，生药4.05 g/kg），苓桂气化方高剂量组（苓桂高剂量组，生药8.10 g/kg），余10只SHR为SHR对照组（SHR组，注射等量生理盐水），相同遗传背景的WKY大鼠作为空白对照组（WKY组，灌胃等量的蒸馏水），每组10只大鼠，WKY组、SHR组和HFpEF组大鼠灌胃等量蒸馏水，除WKY组、SHR组喂食普通饲料，其余各组继续喂食高脂饲料。灌胃给药8周后，第2天空腹，正常饮水，2%戊巴比妥钠水溶液（2 mL/kg体质量）麻醉心脏超声学检测，后腹主动脉取血，病理组织取材进行相应的指标检测。实验过程中对动物的处置符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》和北京市《北京市实验动物福利伦理审查指南》规定的动物伦理学要求并通过医院实验动物伦理委员会的审批（实验动物伦理批准号：2021XLC008-3）。

1.4.3 心脏超声学检测

灌胃结束后，第2天大鼠空腹12 h，麻醉后固定于手术板上，用小动物剃毛器将大鼠胸部的体毛清除干净，仰卧位固定于手术板上行心脏超声检查。7~15 MHz线阵式探头[型号：CL15-7，飞利浦（中国）投资有限公司生产]置于其左胸，在取得满意的胸骨旁左心室短轴二维图像后，高频线阵超声诊断仪[型号：HDI 5000，飞利浦（中国）投资有限公司生产]在乳头肌水平将M型取样线垂直于室间隔和心房及左心室获得M型超声心动图。

同一心动周期的心脏超声功能指标包括舒张早期二尖瓣血流速度（E）；二尖瓣心房收缩期最大血流（A）；舒张早期二尖瓣环心肌运动速度（E’）；左心房射血分数（LAEF）；左心室射血分数（LVEF）。测量时每组原始数据连续测定3个心动周期的平均值，超声检查的操作均由不知道大鼠分组情况的两名经验丰富的超声科专科医生完成。

1.4.4 血脂和血糖指标检测

心脏超声结束后，腹主动脉取血，分离血清备用。HDL-C、LDL-C采用酶比色法；TG采用比色法；TCHO采用酶比色法。GLU采用已糖激酶法，GSP采用终点法检测。

1.4.5 胰岛素类和胰岛素指标测定

FINS采用ELISA双抗夹心法检测，LP、PG、C-P、ANP、BNP分别采用ELISA竞争法检测，操作过程严格按照操作说明书进行。

1.4.6 心脏组织处理方法

血后大鼠，快速取出心脏组织，按随机号将5只放入10%中性甲醛溶液固定，取大鼠心脏的心房组织石蜡包埋，切片（4~6 μm），苏木精-伊红（HE）染色，封片，显微镜下观察。

1.5 统计学处理

所有实验数据由SPSS 13.0统计软件处理，以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布和方差齐性时组间比较采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），组间多重比较采用LSD法。不满足方差齐性用Welch法对F值进行校正，多重比较用Dunnett’s T3法，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 苓桂气化方对HFpEF模型大鼠心脏超声功能的影响

SHR大鼠饲养16周后造成HFpEF模型，结合高脂饲料饮食，E、A发生变化。和WKY组比较，HFpEF组的E、E/A及E/E’比值显著增加（P < 0.01），E’及LAEF明显降低（P < 0.01）。服用苓桂气化方后，和HFpEF组比较，诺欣妥和苓桂气化方高、低剂量组对E、E/A及E/E’比值有显著的改善作用（P < 0.01），诺欣妥组对LAEF有显著提高作用（P < 0.05）。结果见表 1、图 1。

2.2 苓桂气化方对HFpEF大鼠心肌组织病理形态的影响

各组大鼠的心肌心房组织镜下病理可见，WKY组的心房细胞核染色清晰，心肌细胞排列致密、细胞间隙较小；SHR组的心房壁组织有一定的增厚，心房腔增大，形态结构尚正常，但细胞间隙明显增大，细胞排列紊乱，细胞间质纤维增多；SHR大鼠饲养造成HFpEF模型后，可见心房壁明显增厚，心肌细胞排列有一定的间隙、紊乱，可见纤维断裂，部分心肌细胞分割呈网筛状。经过药物治疗后，与HFpEF组比较，各给药组对大鼠心房组织均有一定的改善作用，其中以苓桂高剂量组改善最明显，心室壁厚度明显减轻，心肌细胞体积明显减小，细胞间隙减小，排列较为致密。见图 2。

2.3 苓桂气化方对HFpEF大鼠血清标记物的影响

大鼠造模后，与WKY组大鼠比较，SHR大鼠血中的ANP和BNP含量显著升高（P < 0.01），注射STZ和喂食高脂饮食后ANP和BNP持续升高（P < 0.01）。服用药物治疗后，和HFpEF组比较，苓桂低、高剂量组都有不同程度降低ANP、BNP含量（P < 0.05或P < 0.01），苓桂组成一定量效关系，诺欣妥组仅见BNP水平降低（P < 0.01）。结果见表 2。

2.4 苓桂气化方对HFpEF大鼠胰岛素相关指标的影响

和WKY组比较，SHR大鼠经过16周饲养造成HFpEF模型后，大鼠血清胰岛素相关指标FINS、PG、C-P、LEP、GSP以及GLU等的含量都有不同程度的升高（P < 0.01）。经过药物治疗后，和HFpEF组比较，诺欣妥和苓桂低、高剂量组均对大鼠INS、C-P及LEP有明显的改善作用（P < 0.05或P < 0.01），苓桂低、高剂量组对大鼠GLU有一定的改善作用，且呈一定的量效关系（P < 0.05或P < 0.01），此外，苓桂高剂量组还可使大鼠GSP水平明显降低（P < 0.01）。结果见表 3。

2.5 苓桂气化方对HFpEF大鼠血脂指标的影响

和WKY组大鼠比较，HFpEF模型大鼠血清血脂TC、TG及LDL-C的含量显著升高（P < 0.01），HDL-C含量也有轻度升高。经过药物治疗后，和HFpEF组比较，苓桂低、高剂量组均对大鼠TC及LDL-C有明显的改善作用（P < 0.01）。结果见表 4。

2.6 苓桂气化方对HFpEF大鼠炎症指标的影响

和WKY组比较，SHR大鼠造模成功后，大鼠血清炎症指标hs-CRP含量明显升高（P < 0.01）。经过药物治疗后，和HFpEF组比较，诺欣妥和苓桂低、高剂量组均对大鼠hs-CRP指标有明显的改善作用（P < 0.01），苓桂气化方组无明显量效关系。结果见表 5。

3 讨论

近年来的研究表明，HFpEF是多种病因引起的心室舒张功能不全而收缩功能正常且具有心力衰竭的症状及体征的复杂临床综合征，是一种伴有多种器官功能紊乱的综合征，而不仅是舒张功能障碍的单一疾病。流行病学研究显示，HFpEF约占全部HF患者的一半^[11]，该病好发于老年女性，常合并高血压病、糖尿病、心房颤动、肺动脉高压及肥胖等疾病。

HFpEF具体发病机制尚无定论，目前多数观点认为是由于左心室舒张期心肌顺应性降低以及主动松弛功能受损导致其舒张期充盈受损，心搏量减少，引起左心室舒张末压增高而形成的心力衰竭^[12]。HFpEF患者早期可无明显的临床症状，随着病情的进一步发展，左室舒张功能减低加重，出现肺淤血症状(气短、心悸、呼吸困难等肺淤血表现往往是患者的首诊原因)，病情继续深入发展，会出现肺动脉高压，影响右心室功能，继而导致体循环淤血及HFrEF等病理改变^[13]。

高血压病合并高脂血症模型即是以高脂饲料喂养SHR，构建高血压病合并高脂血症大鼠HFpEF模型，可造成血脂水平紊乱明显，心肌细胞肥厚明显，肾组织小叶间动脉血管壁增厚，提示SHR合并高脂饮食更能模拟人类高血压合并高脂血症的临床表现^[14]。长期高血压状态可使心脏结构发生变化，如心肌肥厚、心腔扩大、质量增加等。近年研究发现，糖尿病和高血压病均可独立影响心脏解剖结构变化，当两者同时存在时这种影响急剧增加，高血压病引起的心脏增大主要在水平方向，心脏从细长向矮胖发展，而糖尿病引起心肌的改变可能在各个方向上均有肥厚，心脏在水平及垂直方向上均有增大^[15]。本实验病理结果显示，WKY组的心肌组织心室壁未增厚，心房心肌形态结构正常，心肌组织肌纤维横纹及细胞核染色清晰。SHR大鼠造成糖尿病模型，结合高脂饲料饮食，造成HFpEF模型后，可见心房壁明显增厚，心腔明显缩小，心肌细胞排列成间隙状，可见纤维断裂，部分排列呈网筛状。说明HFpEF组大鼠心肌组织发生病理形态改变。

既往研究表明，传统HF治疗方案中的血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）、β受体阻滞剂和醛固酮拮抗剂在降低HFrEF病死率方面有明显的作用，但尚无有力的循证医学证据来证实传统治疗方案能改善HFpEF患者预后、改善HFpEF患者的发病率和病死率^[16]。中医术语中并无“心力衰竭”这一病名，结合患者临床症状(胸闷、气短、下肢水肿等)，将其归为中医“心水”“水肿”“喘证”等范畴。病机总属“气虚血瘀水停”，以“益气活血利水”为基本治法。课题组经前期回顾性研究发现，HFpEF气虚程度轻，治以活血利水为主。苓桂术甘汤出自张仲景《伤寒杂病论》，是治疗水饮病的基础方，也被后世称为苓桂剂的祖方^[17]。

本研究苓桂气化方由茯苓、桂枝、白术、赤芍组成，是经方苓桂术甘汤去甘草，合赤芍配伍而成，增强其活血利水之功。现代药理学研究表明，茯苓的主要活性成分为三萜类和多糖类化合物，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血糖、调血脂等作用^[18]；桂皮醛为桂枝的主要活性成分，具有抗炎、降糖、和神经保护等多种药理作用^[19]，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是白术的主要活性成分，其主要药理作用有抗炎、调节胃肠功能、降血糖等^[20]。赤芍总苷是赤芍的主要活性成分，其主要药理作用有改善微循环、扩张血管、抗心肌缺血、抗血栓、抗凝血、改善血流变等^[21]。

超声心动图检查是目前临床上评估HFpEF患者舒张功能的一种主要手段，可以检测到大鼠造模及药物治疗前后E、A、E’、E/A、E/E’、LAEF及LVEF值，E/A比值是临床最常见的评估左室舒张功能的超声指标，而E/E’比值可反映左室充盈压^[22]，正常情况下，1 < E/A < 2。心房利钠肽(ANP)是心房肌在压力超负荷及容量扩张而分泌的神经内分泌激素，BNP是心室在压力负荷及室壁张力改变的刺激下分泌的主要因素，是心力衰竭诊断、疗效评估及判断预后的重要标志物。本研究结果显示，SHR大鼠造模后，大鼠超声心动图E，A值发生变化，和WKY组比较E、E/A及E/E’比值显著增加，E’及LAEF明显降低，大鼠血中的ANP、BNP含量也明显升高，说明HFpEF组大鼠心脏功能发生改变；各药物均对大鼠E、E/A及E/E’比值有显著的改善作用（P＜0.01），苓桂低、高剂量组都有不同程度降低ANP、BNP含量（P＜0.05，P＜0.01），诺欣妥组对LAEF有显著提高作用（P＜0.05），可见BNP水平降低（P＜0.01），表明苓桂气化方对高脂血症、高血压病、糖尿病HFpEF心力衰竭大鼠模型心功能有改善作用，且呈一定量效关系。同时，苓桂高剂量组对大鼠的心肌组织形态具有改善作用，表明苓桂气化方对HFpEF模型大鼠的病理形态恶化具有抑制作用。

炎性反应在HFpEF的发病机制中有着重要的作用，炎性指标C反应蛋白（CRP）是HFpEF患者病死率的独立预测因子，两者呈正相关关系^[23]。本研究结果显示，和WKY组比较，SHR大鼠造模成功后，大鼠血清炎症指标hs-CRP含量明显升高（P＜0.01）。经过药物治疗后，和HFpEF组比较，诺欣妥和苓桂低、高剂量组均对大鼠hs-CRP指标有明显的改善作用（P＜0.01），表明苓桂气化方对复合HFpEF心力衰竭大鼠模型炎症水平有一定的改善作用，可降低炎症因子。

血脂代谢异常与慢性心力衰竭预后有密切的关系，TG、TC和HDL-C水平与CHF的严重程度呈负相关，慢性心力衰竭患者血清TC及HDL-C水平下降，LDL-C升高；多因素Cox回归分析显示较低水平HDL-C是影响冠心病并发慢性心力衰竭患者预后的危险因素，提高HDL-C水平可能改善冠心病心力衰竭患者的预后以及TC水平是慢性心力衰竭终点事件的独立危险因素^[24]。本研究结果显示，与WKY组相比，HFpEF组血清血脂指标TC、TG及LDL-C的含量显著升高（P＜0.01），HDL-C含量也有轻度升高，说明SHR大鼠造模成功；与HFpEF组比较，苓桂低、高剂量组均对大鼠TC及LDL-C有明显的改善作用（P＜0.01），说明苓桂气化方对高脂高血压糖尿病HFpEF心力衰竭大鼠模型血脂状态有一定的改善作用。

胰岛素信号系统异常和代谢底物改变（葡萄糖减少、游离脂肪酸增加），可增加氧化应激和脂毒性，降低代谢效率，引起内皮和线粒体功能障碍，损伤主动松弛功能^[25]。本研究结果显示，与WKY组相比，HFpEF组血清胰岛素相关指标INS、PG、C-P、LEP、GSP以及GLU等的含量都有不同程度的升高（P＜0.01），说明SHR大鼠造模成功；与HFpEF组比较，各药物组血清指标均降低，其中INS、C-P及LEP降低最为明显（P＜0.05或P＜0.01），苓桂气化方低、高剂量组对大鼠GLU有一定的改善作用，且呈一定的量效关系（P＜0.05或P＜0.01），此外，苓桂气化方大剂量组还可使大鼠GSP水平明显降低（P＜0.01），表明苓桂气化方对高脂血症、高血压病、糖尿病HFpEF心力衰竭大鼠模型胰岛素相关指标有一定的改善作用。综上，苓桂气化方对高脂血症、高血糖和高血压病诱导的复合HFpEF心力衰竭模型大鼠具有改善心脏舒张功能，抑制心房结构性重构，并降低炎性因子、改善糖脂代谢及内皮功能的作用。