2021, Vol. 38文章信息
- 王立新, 张彤, 刘秀婵, 王毅
- WANG Lixin, ZHANG Tong, LIU Xiuchan, WANG Yi
- 雷公藤甲素对RA患者T-bet/GATA3及CXCL10/CXCR3表达的影响
- Effect of triptolide on the expression of T-bet/GATA3 and CXCL10/CXCR3 in rheumatoid arthritis patients
- 天津中医药, 2021, 38(8): 1071-1076
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2021, 38(8): 1071-1076
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2021.08.25
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文章历史
- 收稿日期: 2021-02-27
类风湿关节炎（RA）是一种以关节炎、滑膜增生和骨质破坏为特征的慢性自身免疫性疾病，受累滑膜组织中常有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，其中T细胞在RA的发病中处于中心地位[1]。雷公藤是治疗关节肿痛的传统中药，是治疗RA药物中疗效得到肯定的单味中药。雷公藤及其提取物对RA的调节机制主要涉及对T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及多种细胞因子表达的影响[2]。雷公藤甲素（TP）是从雷公藤中分离获得的最主要的抗炎、免疫抑制活性成分[3]。研究显示TP可以降低T细胞对多种细胞因子如白细胞介素（IL）-2、干扰素-γ（IFN-γ）、IL-4、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-17等的分泌，以及抑制T细胞增殖分化从而缓解RA炎症反应[4]。从Th1相关的基因调控和趋化因子表达等方面考察TP的作用机制还值得深入探索和研究。
T-bet和GATA3分别是Th1/Th2细胞的转录因子[5]，Th1细胞分泌的IFN-γ通过JAK1/JAK2信号途径激活、诱导T-bet基因表达，而T-bet又可以诱导Th1分化继续产生IFN-γ，形成正反馈环路。与T-bet作用相反，GATA3促进Th0向Th2细胞分化，这两个基因参与Th1/Th2细胞分化平衡[6]。此外，IFN-γ诱导的趋化因子（CXCL）10通过CXCL受体3（CXCR3）介导活化T细胞，尤其是Th1细胞迁移[7-8]。在RA患者的血清、滑液（SF）和滑膜组织（ST）中，CXCL10表达水平升高，因此CXCL10升高也成为宿主发生免疫反应，尤其是Th1细胞主导的免疫反应发生的标志[9]。与CXCL9和CXCL11相比，CXCL10与CXCR3亲和力更高，CXCL10不仅对T细胞的发育、迁移、黏附起着重要作用，还能活化单核细胞及自然杀伤细胞参与自身免疫疾病的发生过程[10]。以CXCL10/CXCR3为靶标调节免疫细胞的活化和定位用于RA治疗的研究也取得一定进展[11]。
TP对IFN-γ表达具有明确的抑制作用，但TP对RA患者的免疫调节是否也会影响T-bet/GATA3和CXCL10/CXCR3的表达值得探索。本研究欲通过CD3抗体诱导活化RA患者T细胞，在分析TP对Th1、Th2细胞分化及相关细胞因子分泌影响基础上，进一步考察TP对T-bet/GATA3以及CXCL10/CXCR3表达的影响，旨在为TP治疗RA的作用机制进行更深入的补充。
1 材料与方法 1.1 材料、主要试剂及仪器 1.1.1 临床资料本研究经天津市天津医院伦理委员会审核通过（2019医伦审103号），所有研究对象均签署知情同意书。选取2019年11月—2020年1月在天津市天津医院感染风湿免疫科就诊的21例RA患者作为研究对象，其中女性16例，男性5例。患者年龄为17~89岁，平均年龄（56.15±17.66）岁，诊断参照美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）2009年RA诊断标准。
1.1.2 试剂和仪器GT-T551无血清培养基购自Takara公司，重组人IL-2（rhIL-2）购自北京双鹭药业股份有限公司，TP购自成都曼思特生物科技有限公司，人外周血淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，CCK-8试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司，cDNA合成试剂盒、微量样本总RNA提取试剂盒、荧光定量检测试剂盒均购自天根生化科技有限公司。anti-human CD3抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）anti-human CD4抗体、PE anti-human IL-4、APC anti-human IFN-γ、PerCP-Cy5.5 anti-human CXCR3、细胞固定剂、破膜剂、1 000×布雷菲德菌素A（BFA）均购自Biolegend公司。L929成纤维细胞由中国医学科学院生物医学工程研究所提供，Luminex细胞因子检测试剂由国典医药提供，引物合成由上海生工提供。倒置显微镜型号为Olympus CKX41SF，流式细胞仪型号为美国BD Calibur，聚合酶链反应（PCR）扩增仪型号为美国伯乐CFX-96，Luminex检测仪器型号为Luminex 200，酶标仪型号为奥地利Tecan Sunrise。
1.2 实验方法 1.2.1 考察TP细胞毒性本研究选取体外细胞毒性分析模型细胞L929评价TP的细胞毒性。取对数生长期的L929细胞，以1×104个/mL密度接种于96孔板，实验分为空白组（单纯培养基）、对照组（TP浓度为0 nmol/L）、实验组（TP浓度分别为2.5、5、10、25和50 nmol/L），每组5个复孔，分别培养48、72 h。去掉培养上清，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤细胞两遍，每孔加入含有10%的CCK-8新鲜培养基100 μL，37 ℃、5%二氧化碳（CO2）孵育2 h，采用酶标仪检测450 nm的吸光度（A）值。细胞存活率= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%，其中As为实验孔（细胞+TP），Ac为对照孔（细胞），Ab为空白孔（单纯培养基）。
1.2.2 TP对RA患者单个核细胞（PBMC）增殖活性的影响收集10 mL肝素抗凝全血，无菌条件下与PBS缓冲液1∶1混合，将细胞悬液缓慢转移至等体积的淋巴细胞分离液上层，室温条件下490×g离心30 min。吸取中间白膜层单个核细胞，用10倍体积PBS洗涤（490×g，离心10 min）两遍。用含1%双抗、1 000 U rhIL-2的GT-T551培养基调整细胞浓度为1×106个/mL，每孔200 μL接种于CD3单抗（0.5 μg/mL）包被的96孔板中，分为对照组（TP浓度0 nmol/L）、实验组（TP浓度分别为2.5、5nmol/L），每组4个复孔。在37 ℃、5% CO2条件下培养48 h后，用CCK-8检测细胞增殖情况。
1.2.3 流式细胞仪检测Th、Th1、Th2细胞亚群变化和CXCR3表达情况取培养48 h的PBMC细胞，向培养孔内加入终浓度为1×BFA，在37 ℃条件下孵育4 h，用于阻止细胞内因子的释放。离心收集细胞并用PBS洗涤（350×g离心5 min）两遍。每组分别加入FITC anti-human CD4和PerCP-Cy5.5 anti-human CXCR3抗体各5 μL，室温避光孵育20 min；1 mL PBS洗涤两遍后，加入0.5 mL固定液室温避光固定20 min；PBS洗涤两遍后加入1×破膜剂1 mL重悬细胞，350×g离心5 min，重复2次。最后分别加入5 μL的PE anti-human IL-4和APC anti-huma IFN-γ抗体，室温避光孵育20 min，PBS洗涤后置于流式细胞仪检测。
1.2.4 Luminex检测细胞因子表达水平收集PBMC细胞培养上清，分别取50 μL标准品和待测样本，各加入50 μL抗体标记微球，铝箔纸封板，（800±50）r/min震荡条件下室温孵育2 h；洗板两次，在所有孔中加入50 μL的Biotin-检测抗体，室温条件下震荡避光孵育1 h；洗板两次，在所有孔中加PE-链霉亲和素，50 μL/孔，室温条件下震荡避光孵育0.5 h。在所有孔中加100 μL洗液，室温震荡2 min使微球悬浮，在Luminex 200仪器上检测。
1.2.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达变化离心收集培养的PBMC细胞沉淀，PBS洗涤后按照试剂盒说明书提取样本RNA；用反转录试剂盒37 ℃水浴60 min，将RNA反转录为cDNA模板。引物序列检索自Primerbank，使用Pubmed blast分析引物的特异性。具体序列见表 1。检测T-bet、GATA3、CXCL10和CXCR3基因的表达情况，内参基因为GAPDH。每个样本重复检测3次。
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数据采用Graphpad Prism 8.0软件进行处理，实验结果以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多个实验组与对照组之间的两两比较采用Dunnett法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 TP细胞毒性考察在TP浓度 < 2.5nmol/L，培养48 h条件下对L929细胞存活率没有影响（P>0.05），当浓度升高到50 nmol/L时，细胞存活率为（90.93±2.56）%。随着作用时间延长至72 h，TP浓度在10 nmol/L以上时，细胞存活率降低至90%以下，见图 1。以上结果表明浓度在25 nmol/L以内，药物作用时间为48 h时TP无显著细胞毒性（P>0.05）。后续实验在此培养时间及安全剂量范围内进行。
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| 注：A. 培养48 h；B. 培养72 h；与TP浓度0 nmol/L比较，*P < 0.05，#P < 0.01。 图 1 TP对L929细胞存活率的影响（x±s，n=5） Fig. 1 Effect of TP on L929 cell survival rate (x±s, n=5) |
经CD3抗体刺激培养48 h后，细胞形成显著增殖团，显示出CD3抗体可以有效刺激PBMC细胞增殖，见图 2。经CCK-8检测，TP浓度为2.5 nmol/L和5 nmol/L时，PBMC细胞存活率受到显著抑制（P<0.05），两组细胞存活率分别为（82.7±27.57）%、（55.76±21.99）%，并且TP对PBMC细胞的增殖抑制作用具有显著的剂量依赖性。见图 3。
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| 注：A. 无CD3抗体刺激；B. CD3抗体刺激。 图 2 倒置显微镜观察PBMC细胞增殖情况（×50） Fig. 2 Inverted microscope observation of the cell proliferation of PBMC (×50) |
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| 注：与TP浓度0 nmol/L比较，*P < 0.001。 图 3 不同实验条件下PBMC细胞存活率比较（x±s，n=4） Fig. 3 Comparison of survival rate of PBMC in different experimental condition(x±s, n=4) |
实验组在TP浓度为2.5和5 nmol/L时细胞亚群比例分别为（47.17±10.34）%和（44.91±11.89）%，均低于对照组Th细胞亚群比例[（51.34±8.75）%]，两组与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01或P < 0.001），且Th1细胞亚群受抑制程度高于Th细胞亚群，相反Th2细胞亚群有升高趋势，但与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。而Th1与Th2比值在TP调节下显著降低（P<0.05或P < 0.001），见图 4。以上结果提示，TP可以抑制Th、Th1细胞增殖，降低Th1与Th2比值来调节Th1和Th2亚群比例，减少促炎细胞。本研究结果提示TP可能会提高Th2细胞亚群比例，进而抑制Th1细胞的炎症反应发挥对RA的免疫调节作用。
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| 注：与TP浓度0 nmol/L比较，*P < 0.05，#P < 0.01，△P < 0.001。 图 4 TP对Th细胞及Th1和Th2细胞亚群的影响（x±s） Fig. 4 Effect of TP on Th, Th1 and Th2 cell subpopulation (x±s) |
表达CXCR3受体的细胞亚群在TP作用下比例显著降低（P < 0.05），且TP对CXCR3+细胞亚群的抑制同样具有剂量依赖性，见图 5。CXCR3通过与CXCL9、CXCL10、CXCL11等因子相互作用引导炎症细胞向炎症部位趋化，参与RA疾病的发生、发展，因此抑制CXCR3受体表达同样可以减少免疫细胞向炎症部位聚集。
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| 注：与TP浓度0 nmol/L比较，*P < 0.05。 图 5 TP对CXCR3受体表达的影响（x±s） Fig. 5 Effect of TP on the expression of CXCR3 (x±s) |
本研究中除TNF-α外，TP对其余细胞因子的表达抑制作用均具有剂量依赖性，见图 6。在考察的细胞因子中不仅包括促炎因子，也包括抗炎因子。由此可见TP对细胞因子表达的抑制作用是非特异性的，显示出TP具有很强的抑制细胞因子表达的作用。对于TNF-α，当TP浓度为2.5 nmol/L时可以显著降低TNF-α表达水平，随着浓度升高为5 nmol/L时，TNF-α浓度与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。在此浓度下，PBMC细胞存活率显著降低，因此TNF-α表达没有变化可能是TP对免疫细胞活性抑制所致。随着TP浓度升高，在表现出抑制作用的同时，也会对免疫细胞产生一定毒性。
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| 注：1. IL-4；2. IL-10；3. IL-17；4. CXCL10；5. TNF-α；6. IFN-γ；7. IL-6；与TP浓度0 nmol/L比较，*P < 0.05，#P < 0.01，△P < 0.001。 图 6 TP对细胞因子表达的影响（x±s） Fig. 6 Effect of TP on the expression of cytokines (x±s) |
与对照组比较，两个浓度的TP对T-bet和GATA3基因表达及T-bet/GATA3比值均无影响（P > 0.05），所以在本研究中并未观察到TP对这两种基因表达的调节作用。
CXCL10的基因相对表达量在TP浓度为5 nmol/L时受到了抑制（P < 0.05），见图 7，这与其蛋白表达水平变化趋势一致，并且CXCL10蛋白表达受IFN-γ诱导，在TP作用下IFN-γ表达显著下降，也可能是诱导CXCL10表达降低的原因之一。
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| 注：与TP浓度0 nmol/L比较，*P < 0.05。 图 7 TP对CXCR3和CXCL10基因表达的影响（x±s） Fig. 7 Effect of TP on the expression of CXCR3, CXCL10 (x±s) |
RA是一种以滑膜炎症为主的慢性自身免疫性疾病。中药雷公藤具有活血化瘀、去湿止痛的作用，是治疗关节肿痛的传统药物，TP是其最主要的抗炎与免疫抑制活性成分[12]。本研究通过体外实验，从细胞、细胞因子和基因水平分别考察了TP对RA患者PBMC的调节作用。低浓度TP对L929细胞没有毒性，但对活化的PBMC细胞增殖具有剂量依赖的抑制作用，这与之前报道TP治疗窗口窄、毒性大相一致[13]。
Th1和Th2免疫反应失衡是RA发病的重要原因[14]。分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等促炎细胞因子的效应细胞Th1在TP作用下百分比降低，然而Th2细胞没有受到显著调节，因此并未观察到TP抑制Th1同时会促进Th2细胞的特异性调节作用。这种现象可能与药物剂量、作用时间以及免疫微环境中细胞因子、趋化因子等的影响相关，有待进一步研究。Th1/Th2比值显著降低，表明TP可以减少PBMC中效应细胞比例从而缓解RA中的炎症反应。
TNF-α和IL-6被认为是RA滑膜细胞因子网络的中心枢纽[15]，TNF-α不仅会诱导Th1型细胞因子的大量产生，使Th1/Th2细胞的比例进一步失调，也能诱发关节结构和软骨的破坏，参与滑膜炎症反应[16]。现有研究报道靶向TNF-α和IL-6的中和抗体可以有效抑制滑膜炎症反应[17]，因此对TNF-α和IL-6表达的抑制也是TP参与RA免疫调节的重要机制。具有免疫调节作用的IL-4可以诱导巨噬细胞向M2型转化，促进IL-10分泌，并可以将细胞毒T细胞（CTL）转化为分泌IL-4的无细胞毒性细胞，抑制IFN-γ的表达[18]。尽管IL-4和IL-10作为抗炎因子可以协同抑制Th1细胞分化，减少相关炎症因子的分泌及炎性细胞浸润[15]，但本研究中这两种细胞因子在TP作用下表达水平同时降低，可能是因为TP使具有调节作用的如Th2、Treg等免疫细胞活性受到抑制所致。
CXCR3与CXCL10主要参与调节T细胞、NK细胞和巨噬细胞的迁移、分化与激活。CXCR3是体内分泌IFN-γ的Th1细胞所必需的[19]。抗CXCR3抗体AMG487可以降低RA CIA小鼠体内Th1、Th17以及Th22细胞百分比并提高Treg细胞比例[20]。CXCL10可与表达在T细胞表面的CXCR3受体结合促进其活化并向Th1细胞方向分化，在炎症细胞向滑膜组织迁移及活化过程中发挥了关键作用[21]。Lee等[7]研究强调了CXCL10在RA发病机制中的重要性，并提供了先前尚未确定的CXCL10促进关节炎发展机制的细节。因此TP对CXCL10和CXCR3表达的抑制，可以进一步缓解Th1介导的炎症反应，也丰富了其对RA免疫调节的作用机制。
与Th1和Th2细胞分化相关的T-bet和GATA3基因[22]表达没有显著变化，一方面可能是经TP抑制后表达该基因的细胞活性降低，或者由于这两种基因具有复杂多样的生物学功能，如T-bet不仅是Th1型免疫的关键调节因子，在T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、NK细胞效应细胞的建立和维持中也发挥着极其重要的作用[23]。而GATA3基因也会调控Treg细胞的分化[24]，因此在TP作用下并未体现出明显变化。
本研究显示TP对RA具有显著且广泛的非特异性免疫抑制作用。与体外培养细胞系不同，实验中各组样本间统计数据相对离散，正如李彦等[25]对雷公藤肝毒性的评价所述，造成这种现象的原因与每个个体免疫状态、对药物的敏感性以及基因表达差异有关。因此TP作为临床用药还需进一步提高其靶向性，降低毒副作用，如何用于RA临床治疗还有很大研究空间。
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