2022, Vol. 39文章信息
- 陈晶, 袁敏, 侯志涛
- CHEN Jing, YUAN Min, HOU Zhitao
- 基于网络药理学研究孔圣枕中丹“异病同治”失眠及健忘的作用机制
- Mechanistic analysis of Sagacious Confucius' Pillow Elixir in the treatment of insomnia and amnesia with concept of "treating different diseases with same method" based on network pharmacology
- 天津中医药, 2022, 39(10): 1335-1344
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2022, 39(10): 1335-1344
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2022.10.19
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文章历史
- 收稿日期: 2022-08-10
2. 北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和 北京市重点实验室，北京 100700
失眠是全球最普遍的睡眠障碍，自从2019年以来，中国失眠的发生率显著升高[1]。而且失眠是最广泛的精神障碍之一，影响着人们的生理心理健康，往往会导致肥胖和糖尿病、自杀及心血管等疾病发病率的增加[2]。失眠一般指入睡和维持睡眠障碍，最早在《黄帝内经》中记载为“目不瞑”“不寐”，其主要病机是卫行于外，阳不入阴。《类证治裁·不寐》中论述为“不寐者，病在阳不交阴也”。心肾为水火之脏，水火者阴阳也，交通心肾，实则交通阴阳，阴阳交则寐。健忘则指较长时期内记忆力减退、遇事容易遗忘，古籍中称为“喜忘”或“善忘”，常伴有失眠、心悸、头晕等不适。清代林佩琴在《类证治裁·健忘》中指出：“治健忘者，必交其心肾，使心之神明，下通于肾，肾之精华，上升于脑，精能生气，气能生神，神定气清，自鲜遗忘之失。”且健忘症可进行性加重发展为痴呆，给患者及社会造成较重的负担。失眠和健忘虽然属于两种不同的疾病，但研究发现[3]在所有失眠患者中，健忘的伴发率超过了53.42%，是入睡功能障碍患者最主要的伴发症之一。可见，临床上多表现为失眠-健忘共病的患病特点。研究发现睡眠障碍和学习记忆功能存在显著相关性，两者可以相互影响；睡眠障碍的反复发作会影响患者正常的生理功能，还会导致记忆力等认知功能的下降；而记忆力下降等认知功能的损伤也会引起睡眠障碍[4]。
目前，对失眠主要采用认知行为疗法、药物干预、中医药干预等进行防治；但由于认知行为的治疗费时、效果慢且无法普及，以苯二氮卓类、褪黑素受体激动剂和具有镇静抗抑郁等为主的药物治疗也存在着严重的不良反应大、依赖性强、复发率高等问题[5]；而中医药治疗效果显著，不良反应小，临床应用广泛。有关记忆力下降的发病机制尚不明确，临床上治疗此类疾病的靶向药物尚未出现明确疗效。孔圣枕中丹出自唐代孙思邈《备急千金要方·卷十四》，由龟板、龙骨、石菖蒲、远志组成，具有补肾宁心，安神益智的功效。有关孔圣枕中丹的方解清·汪昂在《医方集解》中论述：治读书善忘，久服令人聪明……远志苦泄热而辛散郁，能通肾气上达于心，强志益智；石菖蒲辛散肝而香舒脾，能开心孔而利九窍，祛湿除痰；又龟能补肾，龙能镇肝使痰火散而心肝宁，则聪明开而记忆强矣。既往研究表明，孔圣枕中丹可用于治疗失眠、痴呆、认知障碍、健忘及多动症等多种疾病；孔圣枕中丹有抗抑郁、镇静催眠，以及提高痴呆大鼠学习记忆能力的作用[6-7]。目前，受到传统研究方法的限制，尚未有文献报道临床上常见的失眠-健忘共病的发病机制。
网络药理学是基于系统生态学的理论基础，通过对复杂生物信息系统的网络分析，以及通过选择特殊信息节点实现多靶点药物分子设计的新兴专业。同时，通过融合计算机技术、系统生物学、多方向药理学等多种学科，构建成分-靶标-疾病的分子网络，形成以网络靶标为核心的技术体系，体现了中医的整体论思想和中医“同病异治”及辨证施治的特色，并为揭示证候本质提供了新的解决方案[8]。研究基于网络药理学，从“异病同治”角度对孔圣枕中丹治疗失眠与健忘的作用机制展开了深入研究。
1 资料和方法 1.1 孔圣枕中丹活性成分及靶点的获取运用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.cn/tcmsp.php）和中药成分靶点平台HIT 2.0（http://hit2.badd-cao.net）、中医药整合药理学研究平台（TCMIP，http://www.tcmip.cn/index.jsp）、中医综合数据库（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）、有机小分子生物活性数据库（PubChem，http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、台湾中医药资料库（TCM Database @Taiwan，http://tcm.cmu.edu.tw）及中国天然产物化学成分库（https://pharmdata.ncmi.cn/cnpc）等平台检索孔圣枕中丹的4味中药：远志、石菖蒲、龟板、龙骨的活性成分。口服给药的生物利用度（OB）表示以口服药物总剂量产生药效的百分比，是药物在药代动力学中的主要参数；血脑屏障渗透性（BBB）是潜在物质透过血脑屏障的能力，人类药性指数（DL）指化合物与已知药物的相似性，被广泛应用于评价药物先导化合物能否成药[9-12]。根据OB≥30%、BBB≥-0.3、DL≥0.1，筛选出同时满足此条件的主要活性成分并检索其潜在靶点。再通过Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/），选择物种为人（homo sapiens），获取具有官方名称的靶点信息。
1.2 失眠和健忘相关靶点的筛选在治疗目标数据库（TTD，https://db.idrblab.net/ttd/）、人类基因数据库（GeneCards，https://www.genecards.org/）、毒理基因组学数据库（CTD，http://ctdbase.org/）、药物和药物靶标信息数据库（DrugBank，https://www.drugbank.ca/）和人类的孟德尔遗传数据库（OMIM，http://https://www.omim.org/）数据库获取失眠及健忘的相关靶点，搜索关键词“insomnia”“amnesia”“sleep disorder”“sleep deprivation”“cognitive impairment”“cognitive dysfunction”进行查询，且去掉重复基因及假阳性基因。
1.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建将SCPE的药物活性成分靶点与两种疾病相关靶点取交集，以取得孔圣枕中丹治疗失眠和健忘的共有靶点。以药物、活性成分、作用靶点、疾病为节点（node），两节点间的关系描述为边（edge），并利用Cytoscape 3.7.1软件构建孔圣枕中丹“异病同治”失眠及健忘的“药物-成分-靶点-疾病”网络，度数（Degree）和介数中心性（Betweenness Centrality）则用于进行对各节点间重要性的评价。
1.4 蛋白互作（PPI）网络构建与关键靶点筛选使用STRING数据库解析SCPE治疗失眠与健忘的潜在作用靶点，以及提取共同靶点蛋白互作的网络图，并使用Cytoscape3.7.1软件，实现可视化以及拓扑解析；检测出符合度和介数均大于各自平均水平的关键靶点。
1.5 生物过程分析运用DAVID、Metascape等平台对共有靶点进行分析和可视化，获取Heatmap分析、Mcode（分子复合物检测）分析、GO功能富集分析（即生物学过程、分子生物学功能、细胞学组分）与KEGG通路富集集分析结果。
2 结果 2.1 SCPE活性成分及靶点筛选出39个活性成分，其中远志（Polygala tenuifolia Willd）10个（C1-C10），石菖蒲（Acorus tatarinowii）24个（C11-C34），龟板（Chinemys reevesii（Gray））2个（C35-C36），龙骨（FossiliaOssia-Mastodi）3个（C37-C39）；鉴于龙骨的主要成分Calcium Carbonate（碳酸钙）和Calcium phosphate（磷酸钙）在组方中的作用，虽无法透过血脑屏障，也分析其相应的治疗靶点。经去重后获得化合物对应的靶点88个，其SCPE活性成分和其对应的靶点，见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。
2.2 失眠和健忘相关靶点的获取通过TTD、CTD、DrugBank及GeneCards（人类基因的综合数据库）等数据库检索获得失眠特异性疾病靶点24 771个，健忘特异性疾病靶点55 876个，并进行基因名称标准化处理。通过Venny 2.1.0获取SCPE中各组成药物成分靶点与两种疾病相关靶点的交集，获得孔圣枕中丹治疗失眠和健忘的作用靶点83个。
2.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建使用Cytoscape 3.7.1软件，建立了SCPE治疗失眠及健忘的主要成分-靶点-疾病网络图并进行拓扑解析。此图总共有135个节点、499条边，其中与两个或两个以上的靶点有相互作用影响的药物活性成分有31个。见图 1。
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| 注：橙色圆点即活性成分（C1~C39）；黄色圆点即疾病（失眠，健忘）；绿色六边形即中药（M1~M4，M1：远志；M2：石菖蒲；M3：龟甲；M4：龙骨）；蓝色箭头即靶点。 图 1 药物-成分-靶点-疾病网络图 Fig. 1 Drug-component-target-disease network diagram |
图中药物成分所在位置对应外弧，而其中所对应的药物靶点则位属于内弧，其靶点量的多少也将对应于内弧的长度。深橙色点则是在各种中药中反复出现的靶点，淡橙色则为仅存在于此中药的靶点。紫色的光线连则连起反复出现的靶点，由此可见，石菖蒲、远志、龟板和龙骨这几种药物拥有的共同靶点数量，依次是从多至少。而右图中蓝色的光线则连接反复出现的富集功能条目（富集条目数量＜100），各个药物靶点的功能重叠状况也随之显示。
2.4 蛋白互作（PPI）网络构建及关键靶点将83个SCPE治疗眠和健忘的共有作用靶点导入STRING数据库，并应用Cytoscape 3.7.1对蛋白互作网络实行可视化数据处理及拓扑解析，见图 2。度的大小用节点的大小来显示，即度越小越位于外圈；得到的SCPE治疗失眠和健忘的关键共有靶点（Target）为符合度（Degree）和介数中心性（Betweenness Centrality）都大于平均数的18个靶点。见表 1。由上可知，ESR1、CASP3、NOS3等是与SCPE治疗失眠和健忘关系密切的主要蛋白。
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| 注：圆点代表药物与疾病的共有靶点，圆点的大小和颜色的深浅代表Degree值的大小。 图 2 SCPE治疗失眠和健忘的蛋白互作网络图 Fig. 2 Protein interaction network diagram of SCPE for insomnia and amnesia |
SCPE对治疗失眠与健忘分子机制的深入探究，使用了DAVID、Metascape、R studio软件等平台，针对靶点分别做了GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。并将所得到的前20条富集条目建立了热图，从而利用Metascape和R studio对药物中相应的靶点进行了富集和功能模块化解析，得出了SCPE中治疗失眠和健忘的潜在功能模块（Mode）和各个药物在模型中发生的可能相互作用机制。
2.5.1 聚类热图分析将SCPE治疗失眠和健忘的靶点做聚类分析，获得前20条条目结果：乙酰胆碱反应、神经递质水平的调控、化学突触传递的调节、神经活性配体-受体相互作用、血液循环、蛋白转运调控、温度刺激反应、核受体信号等，更深入的解释了SCPE在治疗失眠和健忘时的复杂机制与过程。
2.5.2 GO富集分析将SCPE对应的靶点导入R和R Studio软件做GO富集分析，把SCPE治疗失眠和健忘的前20条条目进行可视化，结果见图 3。其中，包括205个生物学过程（BP），主要有g蛋白偶联受体信号通路、胆碱能突触传递、平滑肌收缩的正向调节、胞浆钙离子浓度的正向调节、γ-氨基丁酸信号通路、昼夜节律、脂质代谢过程、单胺运输、T细胞激活等；包括78个分子学生物功能（MF），主要有蛋白结合、酶结合、泛素蛋白连接酶结合、乙酰胆碱结合、g蛋白偶联乙酰胆碱受体活性等；包括41个细胞学组分（CC），主要有核、突触、GABA-A复杂受体、神经肌肉接头、依赖camp的蛋白激酶复合物等。
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| 图 3 SCPE治疗失眠和健忘的GO富集分析气泡图 Fig. 3 GO enrichment analysis bubble diagram of SCPE for insomnia and amnesia |
将SCPE对应的靶点导入R和R Studio软件做GO富集分析，把SCPE治疗失眠和健忘的前20条条目进行可视化，结果见图 4。在SCPE治疗失眠及健忘中发挥重要意义的信号通道，主要包括受体配体作用的神经活性、钙信号通路、PI3K-Akt信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号通路、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、胆碱能突触等。
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| 图 4 SCPE治疗失眠和健忘的KEGG富集分析气泡图 Fig. 4 KEGG enrichment analysis bubble diagram of SCPE treatment for insomnia and amnesia |
运用R Studio软件将聚类热图分析的成果进行了生物过程的模块化分解，确定了在各种生物过程中不同药物的具体效果和重要程度。如图 5和表 2。
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| 图 5 SCPE治疗失眠和健忘生物功能的模块化分析 Fig. 5 Modular analysis of the biological functions of SCPE for insomnia and amnesia |
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利用GO富集分析每个模块（MCODE）网络，同时将每个MODE模块的前3项相关条目进行解析。结果显示，SCPE治疗失眠和健忘主要与细胞对有机循环化合物的反应、激素反应及血液循环密切相关。具体到每个药物的分析结果如下：石菖蒲靶点主要干涉了神经活性配体-受体相互作用、细胞对有机循环化合物的反应和神经递质受体的活动过程；远志靶点主要调节对激素的反应和细胞对氮及有机循环化合物的反应过程；龟板靶点主要影响胺受体配体结合和G蛋白偶联胺受体活性及管径调节反应过程；龙骨靶点主要介导凋亡和调节神经元凋亡过程。
3 讨论目前人们的生活和工作压力随着当今社会不断的快速发展在逐渐增大，失眠健忘的发生率也呈明显上升的趋势。虽然失眠和健忘发病病机各有差异，有实有虚；历代医家认为心肾不交是失眠和健忘的主要发病病机之一，心主血而藏神，肾藏精而主志，心肾相交则寤寐协调，思维敏捷，若心肾不交则失眠健忘，并提出了相应的治疗方药如生慧汤、状元丸、定志丸、导痰汤等[13]。孔圣枕中丹是经典复方，主治心肾不足而致失眠健忘、心悸不安，且历史悠久，临床应用广泛，疗效确切。针对心肾不交这一共同病机，孔圣枕中丹治疗失眠-健忘充分体现了中医辨证施治、“异病同治”的特点。
清代陈士铎《石室秘录》第一次明确提出了“异病同治”的概念，并将其定义为：“同治者，同是一方而同治数病也。”异病同治作为中医最基本的治疗原则之一，至今仍应用于临床的诊断和治疗。异病同治的关键是抓主证，通过辨别主诉中的1组证候，认清疾病现阶段的病机，辨证施治，从而确定治法、方药，如此次证则迎刃而解。由于其具体作用机制尚不明确，并且传统中草药组成成分复杂、靶点不清，使其疗效和作用机制的研究存在着一定困难，而网络药理学则可从中药成分、靶点与病症之间作用的整体与系统性关联出发进行研究，有助于进一步发现中药的复杂作用机制和实现异病同治的现代科学内涵。
本研究采用网络药理学方法对孔圣枕中丹进行分析，结果显示SCPE中3个活性最强的物质为2'-O-甲基异甘草素（2'-O-Methylisoliquiriti-genin，C18），异紫花前胡内酯（Marmesin，C13），油酸（oleic acid，C35）；C18和C13来源于石菖蒲，C35则来源于龟板。动物实验和药理学研究发现[14-15]，石菖蒲能提高药物在脑组织中的功效主要与保护血脑屏障和提高其通透性密切相关；而且具有降糖、抗阿尔茨海默病、抗癫痫、神经保护和记忆增强等作用。研究表明龟板能提高细胞免疫功能、调整β肾上腺素受体、清除氧自由基，以及缓解细胞凋亡[16-17]；Ye等[18]发现龟板提取物可通过调节DNMT1核易位和SNCA甲基化，来保护多巴胺能神经元。2'-O-甲基异甘草甙元是一个单体化合物，来自于黄酮类化合物异甘草苷。异甘草苷具有抗真菌活性、抗癌、抗抑郁及神经保护等作用[19-21]。异紫花前胡内酯是一种天然香豆素，具有抗炎、抗肝毒性、抗癌、抗血管生成等作用[22-25]。油酸是一种非必需脂肪酸，有抗炎、抗肿瘤、调节血压和免疫功能等作用[26]。
通过蛋白互作（PPI）网络图可以观察到排在前3位的共同靶点依次为CASP3、ESR1、PPARG，主要与细胞凋亡、雌激素反应、脂代谢有关。CASP3即半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，参与蛋白水解、细胞凋亡以及学习和记忆过程[27-28]。研究发现安眠丹可通过调节线粒体介导的海马神经元凋亡通路和降低Cyt-C、Caspase-3表达来改善睡眠剥夺大鼠学习记忆水平[29]。ESR1即雌激素受体1，存在于与记忆、睡眠和清醒节奏相关的下丘脑、嗅叶、杏仁核和海马区。临床研究发现在AG XBA I或TC PVU II ESR1基因型的围绝经期妇女中，失眠越严重，简单注意力就越差[30]。PPARG即过氧化物酶体增殖物活化受体γ，可参与细胞分化和脂肪生成，胰岛素抵抗，高血压，以及心血管疾病和癌症等过程[31]。另外Han等[32]发现母体睡眠剥夺（MSD）诱导的空间学习和记忆缺陷可以通过小胶质细胞表型的PPARγ依赖性调节来改善。
对靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析的结果显示，SCPE治疗失眠及健忘的主要GO条目有G蛋白偶联受体信号通路、核、突触、蛋白结合、酶结合、泛素蛋白连接酶结合等；参与SCPE治疗失眠及健忘的主要KEGG条目为受体配体作用的神经活性、钙信号通路、PI3K-Akt信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号通路、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、胆碱能突触等。其中，肿瘤坏死因子（TNF）可介导炎症反应和记忆障碍、调节神经元活动（如睡眠调节）等过程[33]；任重阳等[34]发现慢性失眠病人外周血中IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子水平与患者失眠程度、记忆功能呈正相关。孔圣枕中丹改善CI小鼠的认知功能主要通过调控NLRP3/Caspase-1通路，减少血清中IL-6、IL-18和TNF-α等表达发挥作用[35]。细胞凋亡是体内细胞通过激活内部自杀程序而死亡的过程。研究表明，细胞凋亡与失眠、记忆障碍密切相关[36]。张颖等[37]发现左归丸通过上调PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达，减少睡眠剥夺所致神经细胞凋亡，改善睡眠剥夺诱导的大鼠认知功能损伤。加味孔圣枕中丹提高血管性痴呆模型动物的学习记忆能力与对抗缺血再灌损伤后海马区脑细胞的凋亡有关[38]。血管内皮生长因子（VEGF）[39-40]调控神经发育、血液和血管生成，与睡眠障碍和认知功能有关；VEGF的高表达可通过减少Aβ沉积，从而改善AD的学习和记忆等认知功能。实验研究表明[41]加味孔圣枕中丹改善痴呆模型大鼠学习记忆能力的作用机制可能是通过上调VEGF表达，诱导脑组织新生血管生成，从而使皮质及白质缺血区的血供得以恢复和改善。
中枢神经递质，如DA、NE、5-HT和GABA等功能失调时，会破坏节律神经，进而影响睡眠觉醒系统的一般功能，从而逐渐形成了不易入睡、睡眠维持障碍等以失眠最为常见的睡眠障碍[42]。多巴胺（DA）是最常见的兴奋性神经递质，主要产生于中脑边缘系统的神经元中，对维持觉醒起着重要的调节作用；去甲肾上腺素（NE）参与注意力、觉醒和认知的调节，显示出促进觉醒的能力；γ-氨基丁酸（GABA）是与失眠最直接相关的抑制性神经递质之一，在大脑中普遍存在，且GABA浓度的增加，可增加深慢波睡眠[43-44]。Wang等[43]发现百乐眠通过调节神经递质水平即GABA，5-HT，DA，NE含量升高，Glu含量降低来减轻氯苯丙氨酸诱导的失眠。另外，DA、GABA及NE参与学习和记忆过程，而且阻断触发DA刺激系统和以突触后D-2受体为主的抑制性GABA能系统的激活等耦合过程是健忘症发展的神经化学基础[45-47]。Tellez等[47]发现记忆形成的机制可能与与前额叶皮质γ-氨基丁酸、纹状体5-羟色胺、多巴胺等上调，海马γ-氨基丁酸和5-羟色胺等下调有关；且参与抗健忘作用的主要神经传递系统是多巴胺和5-羟色胺。Sadowski等[46]研究发现利多卡因通过抑制杏仁核内去甲肾上腺素的释放来减轻茴香霉素诱导的记忆障碍。
泛素化是指泛素分子在泛素激活酶（E1）、几种泛素结合酶（E2s）和许多泛素连接酶（E3s）的协调催化下特异性修饰靶蛋白的过程。泛素连接酶E3，作为泛素化过程最后步骤中的重要酶，在与靶蛋白的特异性识别中起关键作用，且介导了癌症、阿尔茨海默症及帕金森病等多种疾病，目前仍是泛素化研究领域的热门话题。E3泛素连接酶Cullin-3可在昼夜节律和睡眠调节中起重要作用，Li等[48]发现Cullin-3的适配器失眠inc家族蛋白能指导并影响睡眠和突触功能的保守神经元底物泛素化。另外研究表明E3连接酶Neuralized1依赖性泛素化通过调节CPEB3和CPEB3依赖性蛋白质合成和突触形成的活性来促进海马可塑性和海马依赖性记忆存储[49]。由于泛素化系统的复杂性，很多问题仍有待研究，如采用传统方法研究E3和底物之间复杂的交叉作用等。
由于泛素化系统的复杂性，很多问题仍有待研究，如采用传统方法研究E3和底物之间复杂的交叉作用等。
总之，研究基于网络药理学预测发现孔圣枕中丹“异病同治”失眠及健忘可能通过抗细胞凋亡、炎症反应、神经递质、泛素蛋白连接酶结合等多种途径发挥共同治疗作用，与目前失眠及健忘的研究方向相同，表明了网络药理学预测结果的可靠性与准确性。但是尚不明确没有靶点的化合物，是否发挥了同类型化合物的作用；且异病同治的机制研究由于受到复合模型稳定性等因素的限制，虽然进行了生物信息学的研究，但后续的动物模型及临床研究仍需进一步深入。基于网络药理学的作用机制研究可为孔圣枕中丹临床上新的应用提供参考，也为中药复方“异病同治”科学内涵的诠释提供了科学依据。
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