慢性肾脏病（CKD）现今已成为一种严重危害人类生命健康的慢性疾病。肾间质纤维化（RIF）是各种CKD发展至终末期肾病的共同通路，是CKD的主要病理表现^[1]。近年来，随着肥胖、糖尿病、高血压的增多^[2]，CKD的发病率也普遍上升^[3]，RIF人数也随之增长。多项研究发现，延缓RIF进展可有效保护尚未损坏的肾功能，对CKD的治疗有重要意义。

中医药在治疗肾脏病中积累了丰富经验。肾疏宁是黄文政教授以“疏利少阳三焦”为主要治则，经天津中医药大学第一附属医院肾病科多年临床实践研究，筛选组合而创的中药复方^[4]，由柴胡，黄芪，黄芩，丹参，鬼箭羽，山茱萸，萹蓄，白花蛇舌草，益母草组成。现代药理研究^[5-6]发现，肾疏宁能改善肾小球系膜功能和肾小管的通透性，优化蛋白质的代谢^[7]。王耀光教授临床实践^[8]证明肾疏宁方能明显改善患者的临床症状、部分肝肾功能指标，并能减少尿蛋白，对CKD有一定疗效。

网络药理学通过网络和软件分析来预测中药的作用机制，为中医药研究提供了一种新的思维方式，使中药多成分、多靶点的治疗特点在临床治疗中能充分发挥其优势^[9]。本文基于网络药理学，结合分子对接技术，以分析肾间质纤维化高度相关的信号通路为主，探讨肾疏宁防治肾间质纤维化的机制，以期为临床运用提供参考。

1 材料与方法 1.1 肾疏宁相关靶点筛选

借助中药系统药理学分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索肾疏宁中（柴胡，黄芪，黄芩，丹参，鬼箭羽，山茱萸，萹蓄，白花蛇舌草，益母草）9味中药的化学成分^[10]，TCMSP数据库设定口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥ 0.18，初步筛选出活性成分及作用靶点，并根据相关文献进行补充。借助Uniprot蛋白质数据库（https://www.uniprot.org）将化合物的蛋白质靶点与其基因名进行对应匹配；建立肾疏宁化学成分-靶点数据库。

1.2 肾疏宁防治肾间质纤维化相关靶点筛选

通过检索GeneCards数据库（https://www.genecards.org）、药物靶标数据库（TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）、在线《人类孟德尔遗传》数据库（OMIM，https://www.omim.org），以“Renal Interstitial Fibrosis”为关键词，检索出防治疾病的潜在靶点。合并所有疾病数据库靶点删除重复值得到最终疾病相关靶点，将两者靶点进行映射并绘制韦恩图。

1.3 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图的构建

运用CytoScape3.8.0构建肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图，并分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）及紧密度（Closenesss Centrality）等，最后根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.4 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点PPI网络构建

为了找出药物与疾病靶点间的相互作用关系，将两者交集靶点进行互作分析，利用Cytoscape3.8.0软件构建PPI网络并进行可视化呈现。

1.5 肾疏宁成分-肾间质纤维化功能与通路的富集分析

将肾疏宁防治RIF的靶点录入DAVID Bioinformatics Resources 6.8平台，设定P < 0.05，进行基因本体论（GO）生物学过程富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，根据P值FDR值大小排序，并选取排名高的信号通路通过在线绘图网站bioinformatics（http://www.bioinformatics.com.cn）将其结果进行可视化呈现；并构建肾疏宁防治肾间质纤维化的靶点-通路网络图。

1.6 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点的分子对接

将肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图中度值，介度，紧密度高的活性成分通过ZINC（http://zinc.docking.org）网站查找其3D结构。将PPI网络中度值排名靠前的靶点从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）中找出其3D结构，通过AutoDock Tools 1.5.6逐一对接，只保留Affinity（kcal/mol）绝对值最高的对接结果，并用R语言绘制热图。再利用Pymol软件进行可视化呈现。

2 结果 2.1 肾疏宁活性成分靶点获取

初步提取肾疏宁的中药成分，筛选得到有效成分柴胡17种，黄芪20种，黄芩36种，丹参65种，鬼箭羽8种，山茱萸20种，萹蓄2种，白花蛇舌草7种，益母草8种。得出每味药物成分的作用靶点，柴胡88个，黄芪98个，黄芩62个，丹参74个，鬼箭羽82个，山茱萸42个，萹蓄69个，白花蛇舌草88个，益母草100个，合并删除重复值后得到靶点232个。根据OB和DL高低筛选出主要活性成分为山柰酚、槲皮素、异鼠李素、豆甾醇等（见表 1）。

2.2 肾间质纤维化相关靶点获取

从Genecards数据库找出疾病靶点2 783个，设定Score > 5.3（中位数）。并结合OMIM、TTD数据库补充相关靶点，合并删除重复值后得到1 371个相关靶点。将筛选的药物靶点与疾病靶点取交集，并绘制韦恩图，得到中药药物成分-疾病共同靶点116个（见图 1）。

2.3 肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图构建

运用CytoScape3.8.0构建肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点网络图（见图 2）。中药与疾病相关的活性成分130个，包含中药共有成分10个（见表 2），药物独有成分丹参56个、黄芩28个、柴胡8个、山茱萸8个、黄芪14个、白花蛇舌草1个、益母草4个、鬼箭羽1个、扁蓄0个。并分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，其中排名前8的成分依次为槲皮素、矮牵牛素、异鼠李素、花生四烯酸、山奈酚、丹参酮、联苯酸脂、豆甾醇（见表 3）。

2.4 PPI网络构建

将肾疏宁成分-肾间质纤维化靶点提交至STRING11.0平台，利用Cytoscape3.8.0软件构建PPI网络（见图 3），并根据其degree值将其可视化（见图 4）。肾疏宁治疗RIF的主要潜在靶点为肿瘤坏死因子（TNF），蛋白激酶B1（AKT1），JUN，丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1），RELA，TP53。

2.5 富集分析

应用DAVID 6.8数据平台对肾疏宁防治肾间质纤维化相关靶点进行分析，通过在线绘图网站bioinformatics以及R语言将其结果进行可视化呈现（见图 5）。GO富集结果表明肾疏宁治疗疾病可能通过炎症反应、细胞凋亡、氧化应激反应等过程调节发挥作用。KEGG分析结果显示这些靶点主要富集映射在TNF、NF-κB、AGE-RAGE等高度相关的信号通路（见图 6、表 4）。并以前25条通路构建肾疏宁防治肾间质纤维化的靶点-通路网络图（见图 7）。

2.6 分子对接

结果显示有效活性成分豆甾醇、丹参酮、异鼠李素与核心靶点之间有较好的结合活性；核心靶点TNF、RELA与有效成分的结合活性较好（见图 8）。同时借助Pymol2.5.0软件分别对山奈酚与TNF，异鼠李素与TNF，豆甾醇与TNF，丹参酮与TNF，异鼠李素与RELA，豆甾醇与RELA进行分子对接可视化（见图 9）。

3 讨论

肾间质纤维化是CKD的病理标志和主要表现^[1]。依据其临床症状及发病特点，中医可归属于“水肿”“癃闭”“关格”“虚劳”“肾风”等病证范畴^[11-12]。黄文政教授认为湿热内蕴是本病的主要病机，肾疏宁是在以“少阳主枢”“三焦气化”为理论指导创立的，以疏利少阳为主要治则，并兼有补肾气、降瘀浊、解湿毒的功效。方中柴胡、黄芩为主，枢利少阳三焦湿热；黄芪、益母草、山萸肉益气养阴，补肝肾；丹参、鬼箭羽、萹蓄、白花蛇舌草等清湿热活血解毒。诸药搭配，疏利少阳，扶正祛邪^[13]。

肾间质纤维化的主要病理过程包括：上皮-间质细胞转分化（EMT）、细胞外基质（ECM）沉积、氧化应激、细胞凋亡、血管紧张素系统活性升高及各种细胞因子间的相互作用等^[14]。本研究基于网络药理学对中药复方深入分析挖掘，阐述肾疏宁防治肾间质纤维化在整体分子水平上的作用机制^[15]，研究结果显示肾疏宁可作用于RIF的中药活性成分有130种，相关作用靶基因116个。KEGG分析结果显示肾疏宁防治肾间质纤维化主要作用与TNF、NF-κB、AGE-RAGE等信号通路有关，尤以TNF、NF-κB通路密切相关。

TNF-α是参与肾间质纤维化重要的炎症因子之一，能够有效刺激肾小管上皮细胞产生一系列炎症细胞，诱导肾小管上皮转分化或凋亡，加速肾间质纤维化发展。TNF-α还能通过刺激NF-κB通路将其活化诱导细胞的表型转化^[16]。被激活的NF-κB反过来促进TNF-α的形成，使NF-κB与TNF-α形成反馈环^[17]。NF-κB作为炎性反应基因，在肾小球细胞、肾小球上皮细胞和肾小管上皮细胞中均有表达^[18]，被激活后能产生更多的炎性因子，发生炎症反应，促进肾纤维化的发展。另外，NF-κB还可诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，也可导致纤维化形成。AGE-RAGE信号通路是通过促进肾脏的炎症反应和纤维化过程，促使肾脏结构损伤，最终导致肾功能丧失。AGE-RAGE通路可通过诱导NF-κB的激活和氧化应激作用，进一步刺激促炎细胞因子产生。

研究发现转化生长因子-β（TGF-β）的表达随着NF-κB的活化而升高^[14]，TGF-β1目前被认为是肾间质纤维化过程中最关键的生长因子之一，TGF-β1是EMT过程的主要诱导因子，对肾间质纤维化发生、发展的多个环节有重要影响。通过研究可得肾疏宁可能主要通过调节TNF蛋白靶点激活NF-κB通路，减少炎性因子和纤维形成因子产生^[15]，同时也会调节TGF-β/Smad信号通路，从而减少肌成纤维细胞数量，调节ECM的表达，减少细胞炎性损伤，抑制炎症反应和纤维化过程，起到治疗肾间质纤维化的作用。

为了进一步验证肾疏宁对RIF治疗作用的药效物质基础，本研究对肾疏宁的核心化合物与TNF、RELA进行分子对接分析，可见核心活性化合物均能与TNF、RELA通过氢键等作用稳定结合。氢键是稳定对接体系的重要作用力^[19]，核心活性化合物与TNF、RELA结合均有氢键形成。一般认为，结合能绝对值大于5 kcal/mol表明化合物与靶点蛋白之间结合活性较好；绝对值大于7.0 kcal/mol表明小分子与受体蛋白具有很强的结合活性^[20]。分子对接结果显示山奈酚与TNF结合能绝对值为8 kcal/mol，丹参酮与TNF结合能绝对值为8.3 kcal/mol，异鼠李素与TNF结合能绝对值为8.3 kcal/mol，异鼠李素与RELA结合能绝对值为8.3 kcal/mol。值得一提的是，豆甾醇与TNF结合能绝对值为10 kcal/mol，豆甾醇与RELA结合能绝对值为9.7 kcal/mol。根据研究结果考虑豆甾醇在调节RIF过程中发挥重要作用。汤利华等^[21]研究发现，山奈酚可降低TNF-α等的表达，使炎性细胞浸润降低，缓解肾组织损伤。研究结果显示丹参酮可通过改变TGF-β/Smad和NF-κB通路的表达来抑制RIF和炎症反应^[22]。田锋等^[23]认为异鼠李素其作用机制可能是抑制了NF-κB信号转导系统的过度活化及氧化应激。同时肾疏宁中多种活性成分都对RELA表达产生影响，通过抑制NF-κB的蛋白表达，减少炎症反应，从而达到防治肾间质纤维化的目的。

本研究利用网络药理学与分子对接技术，分析了肾疏宁治疗肾间质纤维化的作用机制，揭示了肾疏宁防治RIF可能的相关信号通路、靶点蛋白及活性化合物，为临床慢性肾脏病的防治和后续深入研究奠定了理论基础。但由于网络药理学分析方式存在局限性、中药复方较复杂、药物间相互作用不明确及体内代谢差异等的影响，无法明确中药成分的全部药理作用，还需要临床试验和动物试验来进一步验证。