膜性肾病（MN）是一种自身免疫性肾小球疾病，诊断依赖于肾穿刺，病理表现主要是肾小球基底膜弥漫性增厚并伴有免疫复合物的沉积。目前已经证实血清抗磷脂酶A2抗体（PLA2R）滴度水平与疾病的活动性具有相关性^[1]。发病年龄以中年男性居多，近年来发病人数在逐步攀升^[2]。环境污染与MN发病人数的增加密切相关，研究显示^[3]，空气中PM2.5浓度的增加与患MN的风险之间呈现一定的相关性。临床上MN患者以大量蛋白尿、水肿为主要表现。大量蛋白尿的产生与足细胞的损伤密不可分，遗传、药物等因素会导致足细胞足突融合、数量减少、结构和功能受损，滤过膜通透性发生改变，蛋白漏出而形成蛋白尿^[4-5]。足细胞的正常工作依赖骨架蛋白的维系，骨架蛋白主要由中间丝、微管及肌动蛋白微丝构成，每个部分均分布着与足细胞相关的特殊蛋白，其中紧密连接蛋白ZO-1、骨架蛋白synaptopodin即为足细胞相关蛋白，对维持足细胞的结构和功能具有重要意义^[6-7]。因此恢复受损的足细胞，改善滤过膜的完整性和通透性对减少蛋白尿保护肾功能作用重大。

在中医基础理论指导下，辨证运用中医药治疗MN在临床上效果显著。中医古籍认为“蛋白质”属于精微物质，其输布运行与三焦有着密切的关系。《五脏穿凿论》曰“肾与三焦相通，肾与命门相通。”据此后代医家在治疗肾脏疾病时多注重调和三焦，补益肾脏。《难经》云：“三焦，水谷之通道，气之所始终也。”可见三焦是气血津液正常输布的重要通道，是联络各脏腑的通路。MN患者多病程长久，易导致脏腑亏损，加之近年来人们饮食结构的改变、生活压力的增加、饮食劳倦等多种因素导致脾无力运化，则易酿生湿邪。三焦祛湿方（黄芪、淫羊藿、丹参、川芎、红花、水蛭、藿香、陈皮、白豆蔻、积雪草、炒白术、茯苓）具有宣通三焦、活血通络、祛湿化痰的作用，是陈志强教授根据临床经验总结出的治疗MN的有效方剂。课题组前期的临床观察显示^[8]：宣通三焦、活血通络法可以显著降低MN患者的尿蛋白，保护肾功能，延缓疾病的进展。本研究拟通过复制MN动物模型，探讨该方可能的肾保护作用机制以及对ZO-1、synaptopodin蛋白表达水平的影响。

1 实验材料 1.1 实验动物

雌性Balb/c小鼠60只，体质量16~19 g，6~8周龄，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2016-0006。本实验方案由河北中医学院动物伦理委员会批准。

1.2 实验试剂

C-BSA（美国Chondrex公司，批号9058）；弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，批号F5881）；ALB（血清白蛋白）测定试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号200923）；Scr（血肌酐）、BUN（尿素氮）、TC（总胆固醇）测定试剂盒（贝克曼库尔特实验系统有限公司，批号分别为AUZ3592，AUZ3625，AUZ3611）；ZO-1抗体、synaptopodin抗体（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号GB111402、GB111049）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号GB23303、GB23301）；FITC标记的山羊抗小鼠IgG（美国KPL公司）；ACTIN抗体（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号GB12001）。

1.3 实验药物

盐酸贝那普利片（深圳信立泰药业股份有限公司，批号H20054771）；三焦祛湿方颗粒剂型：黄芪、淫羊藿、丹参、川芎、红花、水蛭、藿香、陈皮、白豆蔻、积雪草、炒白术、茯苓（广东一方制药有限公司，批号分别为：012263，010049，101123，101149，101149，012028，004636，012165，009644，011590，011271，012347）。

1.4 实验仪器

7170A型全自动生化分析仪（Hitachi公司）；BX43型免疫荧光显微镜（日本Olympus公司）；BX51型光学显微镜（日本Olympus公司）；双垂直电泳仪（北京六一仪器厂）；Image Quant LAS4000型化学发光成像分析仪（美国GE Healthcare公司）。

2 实验方法 2.1 造模与分组

造模60只小鼠测定24 h尿蛋白定量（24 h-UTP）均小于22 μg。随机分组，给予小鼠尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）进行建模^[9]。预免疫：造模组给予0.2 mg C-BSA与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后多点位皮下注射；对照组用等体积的弗氏完全佐剂多点位皮下注射。2周后，正式免疫：造模组给予小鼠尾静脉注射C-BSA（6.5 mg/kg），隔日1次，持续6周；对照组尾静脉注射生理盐水代替，余操作相同。实验8周后，造模组小鼠共死亡6只，造模组余下的小鼠测24 h-UTP均大于60 μg，提示造模成功^[10]。造模组小鼠随机选取4只做肾组织免疫荧光检查，均观察到免疫复合物沿毛细血管壁呈颗粒样沉积，证实MN造模成功。然后将造模组剩余的40只小鼠随机分为4组，模型组（10只）、中药低剂量组（10只）、中药高剂量组（10只）、盐酸贝那普利组（10只）。

2.2 给药方法

8周后，空白组和模型组都给予蒸馏水0.2 mL灌胃；中药低剂量组、中药高剂量组分别给予三焦祛湿方3.71 g/kg、7.42 g/kg，灌胃治疗；盐酸贝那普利组将盐酸贝那普利片溶于羧甲基纤维素钠中，按照1.3 mg/kg灌胃给药。共给药4周。于实验第12周末取材。留取尿液，血液，肾标本做进一步分析。

2.3 检测 2.3.1 尿、血标本的检测

给药后留取小鼠的24 h尿液，测24 h-UTP。在给药后第4周末，用异氟烷吸入麻醉小鼠，腹主动脉取血，进行TC、Alb、BUN、Scr等指标的检测。

2.3.2 肾脏行病理形态观察

肾组织经固定，脱水，包埋，切片后分别行苏木素-伊红（HE）染色、马松（Masson）染色、过碘酸-六胺银（PASM）染色，在光镜下观察肾组织的结构形态。

2.3.3 免疫荧光法检测小鼠肾脏IgG的沉积

从4 ℃冰箱取出肾组织，OCT包埋，迅速放入-20 ℃冷冻切片机中切片（4 μm），丙酮固定5 min，再用磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗3遍，避光封闭免疫球蛋白G（IgG）抗体，室温下孵育1 h，PBS再次浸洗，于荧光显微镜下观察荧光强度并做好记录。

2.3.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测目的蛋白的表达

取出肾组织，剪取100 mg，放入离心管中，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，裂解组织，于冰上操作。裂解后，4 ℃，离心10 min（12 000 r/min），离心半径10 cm，BCA法检测组织上清液中蛋白浓度。将蛋白溶液按4∶1的比例加入5×蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min使蛋白变性。加样，经凝胶电泳（根据分子量的大小选择合适的分离胶浓度）进行蛋白分离，转膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗膜3次，滴加二抗，室温摇床孵育1 h，然后进行发光，显影以及蛋白表达量的分析。

2.3.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果 3.1 给药后小鼠尿液24 h-UTP及血清TC、ALB、Scr、BUN的表达

与空白组相比，模型组小鼠尿液UTP增高，血清TC增高，ALB降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。各治疗组与模型组比较，尿液UTP降低，血清TC降低，ALB增高，差异有统计学意义（P < 0.05）；各治疗组间比较UTP、TC、ALB，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组小鼠Scr和BUN比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

3.2 对肾组织病理形态的影响

光镜下观察空白组上皮细胞、基底膜、内皮细胞、系膜细胞及基质、肾小管以及肾间质形态结构均未见明显异常；模型组可见小鼠肾组织肾小球体积增大，MASSON染色可见基底膜增厚，部分可见到嗜复红蛋白沉积，PASM染色可见“钉突”形成；与模型组比较，各治疗组可见肾小球体积有所减小，偶见嗜复红蛋白沉积，基底膜增厚减轻，“钉突”减少。见图 1。

3.3 免疫荧光观察结果

空白组几乎未见免疫复合物的沉积；其他各组均有不同程度的IgG沿肾小球毛细血管基底膜的沉积。模型组荧光染色较强，各治疗组与其相比IgG的沉积明显减少，荧光强度明显减弱。中药高剂量组与盐酸贝那普利组的IgG沉积无明显差异，在荧光强度上均弱于中药低剂量组。见图 2。

3.4 对肾组织ZO-1、synaptopodin蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组ZO-1、synaptopodin的表达显著减少（P＜0.05）；与模型组相比，各治疗组ZO-1、synaptopodin的表达明显增加（P＜0.05），各治疗组间比较ZO-1、synaptopodin差异没有统计学意义（P＞0.05）。见表 2，图 3。

4 讨论

MN是肾脏病中较为常见的疾病类型，由于目前没有特效药物，且容易带来一系列并发症，因此在临床治疗中颇为棘手，蛋白尿的大量丢失是疾病加重的重要原因。而大量漏蛋白主要是肾脏足细胞受损，足突融合消失，滤过膜的完整性被破坏，蛋白漏出形成蛋白尿^[11]。其预后与临床表现具有很大差异，关于疾病的进展有着经典的“三分之一理论”^[12]，虽有一定的自发缓解率，但仍需警惕MN可能带来的血栓栓塞等严重并发症。MN的患者应自确诊之日起接受支持治疗，尽量减少蛋白质的排泄，以改善预后，提高生活质量。

目前西医的治疗方案主要是激素加免疫抑制剂，同时辅以降压护肾、调节糖脂代谢、抗凝等治疗，取得了一定的临床疗效，但因药物带来的满月脸、水牛背、感染、骨质疏松等不良反应以及停药后易反弹等局限性，长期应用效果欠佳，因此给临床治疗带来很大的挑战。中医认为MN属于“水肿”“尿浊”等范畴。课题组在长期的临床观察中发现，MN患者日久均有脾肾亏虚之象。中医理论认为脏腑亏虚日久无力鼓动气血运行，则三焦气化不利、血液凝滞；瘀血即为病理产物又是致病因素，故血瘀为MN患者的重要病因之一。导师陈志强教授有着多年的临床经验，在治疗MN方面有着独到的见解。陈教授认为MN“脾肾气阳两虚，水湿痰瘀内阻，三焦气化不利”为病机关键^[13]。脾肾为MN的主要病位，脾肾亏虚导致气血运行不利，气虚易发展成阳虚，阳虚不能温化水湿，水液停聚机体，形成水肿；血不利则为水，亦成水肿；脾肾亏虚失去升清固摄之职，则蛋白易漏出形成蛋白尿。三焦作为脏腑功能正常运行的主要通道，在水液输布中起着重要作用。一旦受损，则上焦不能宣散，中焦不能燥化，下焦不能泄利，三焦气化功能失司，水湿邪浊留滞机体，则易发生病变。

据此，陈教授自拟三焦祛湿方治疗MN，方中黄芪、炒白术、淫羊藿益气温阳，化气行水；藿香化湿通上焦，陈皮、白豆蔻燥湿运中焦，积雪草、茯苓渗湿利下焦；丹参、川芎、红花、水蛭活血化瘀通络。其中黄芪是必用药，研究显示^[14]，黄芪的有效成分黄芪甲苷Ⅳ可减少细胞骨架的丢失调节相关通路蛋白，恢复足细胞形态，减轻足细胞损伤。中医认为久病入络，络脉纤细深邃，血流缓慢，易发生瘀滞。红花、川芎等植物类的活血化瘀药力难以触及深部，而水蛭等动物类的化瘀通络药能破血逐瘀，消除癥瘕积聚，直捣疾病深处。现代药理研究认为水蛭是作用较强的凝血酶抑制剂，而且对炎性介质具有拮抗作用，能够减弱免疫复合物的沉积，减轻蛋白尿，保护肾功能^[15]。近年来中医药在治疗疾病方面的优势逐渐凸显，但确切的分子机制尚不明确，本研究主要是探讨中药三焦祛湿方对MN小鼠足细胞蛋白表达的影响，以进一步探讨MN尿蛋白减少的可能生物学机制，为临床提供参考。

足细胞是终末分化的细胞，为肾小球提供结构支持，由胞体、初级突起、足突3部分构成，对维持完整的肾小球滤过屏障至关重要，可因遗传、药物、感染等诱因被破坏，且破坏之后功能难以恢复^[16]。目前认为MN的足细胞破坏，主要是由于肾小球上皮下免疫复合物的沉积，补体系统被激活，形成膜攻击复合物C5b-9，C5b-9导致足突的融合、凋亡等改变，是蛋白尿加重的重要原因^[17-18]。裂孔隔膜蛋白和骨架蛋白的异常表达是足细胞受损的重要表现。毗邻足突之间有规律的相互交错，在它们之间形成的间隙为裂孔，之间有裂孔膜桥连接形成裂孔隔膜。ZO-1是分子量为220 kd的蛋白质，在肾小球主要表达于足细胞足突胞质侧裂孔隔膜附近，属于鸟苷酸激酶家族的一种链接蛋白，主要附着在裂孔隔膜上，ZO-1与neph-1相互作用形成一个结构稳定的蛋白复合体，形成裂孔隔膜的重要组成部分之一。ZO-1将裂孔隔膜与足细胞骨架蛋白actin相连接，以维持足细胞滤过膜的完整性。Mark C Wagner等^[19]研究显示肾小球损伤后，足细胞消失，ZO-1与neph-1出现解离，两者之间的相互作用丧失，裂孔隔膜的结构被破坏。表明ZO-1在足细胞裂空隔膜复合体中发挥重要作用。足细胞中ZO-1特异性表达的缺失，会损害裂孔隔膜的形成，导致蛋白尿和肾小球硬化^[20]。文献资料^[6]显示，在C-BSA诱导的MN大鼠模型中ZO-1的表达下降，经药物治疗后其表达量有所增加，表明ZO-1蛋白表达的减少可能是尿蛋白加重的影响因素。

骨架蛋白以肌动蛋白为主，维持着足细胞的特殊结构。synaptopodin是分子量为100 kd的蛋白质，是骨架蛋白的重要组成部分，一种富含脯氨酸的肌动蛋白结合蛋白^[21]，与α-actinin-4相互作用，和紧密连接蛋白一起与肌动蛋白微丝密切相连，维持足细胞的结构和功能。synaptopodin调控下游蛋白RhoA的表达，RhoA是影响细胞信号转导的重要蛋白之一，对维持肾小球的滤过屏障具有重要作用^[22]。synaptopodin表达量的降低，会引起足突融合，肌动蛋白细胞骨架的重组。研究显示^[23]，C-BSA诱导的膜性肾病大鼠肾组织synaptopodin的表达明显下降，治疗组与模型组相比其表达量明显增加，表明synaptopodin表达的减少会加重蛋白尿。据报道^[24]，synaptopodin是环孢素的作用靶点，环孢素能够抑制钙调磷酸酶的活性，增加突触足蛋白的丰度，从而起到降低蛋白尿的作用。本研究显示MN小鼠肾组织中ZO-1、synaptopodin的表达减少；与模型组相比，各治疗组ZO-1、synaptopodin的表达均有增加，与文献中的研究结果是一致的。进一步说明了ZO-1、synaptopodin的表达对维持足细胞正常功能和结构起着重要作用。

本实验采用尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白诱导小鼠出现MN的病理模型，给予高、低剂量的三焦祛湿方或盐酸贝那普利片干预，研究表明造模后小鼠出现肾小球毛细血管基底膜增厚、钉突形成、免疫复合物沉积等病理改变，血清白蛋白降低、血脂升高等生化的改变，经三焦祛湿方干预后，MN小鼠的蛋白尿、血脂显著降低，血清白蛋白明显升高，疗效与西药组相当。各组小鼠血清尿素氮、肌酐相比变化不大，分析原因可能与实验时间短，造模后小鼠肾功能尚处于代偿阶段有关。对目的蛋白ZO-1、synaptopodin的检测显示：造模组ZO-1、synaptopodin表达显著减少，经三焦祛湿方治疗后ZO-1、synaptopodin表达显著增多，由此笔者推测三焦祛湿方减少蛋白尿的机制可能是通过增加ZO-1、synaptopodin的表达，修复足细胞的完整性，从而减少蛋白的漏出，证实了三焦祛湿方治疗膜性肾病是有效的。但是由于检测数据的误差、实验中的不可控事件以及客观实验条件的限制等因素，使得实验存在一些不足，其进一步的机制有待未来更深入的研究。