糖尿病肾病（DN）是1型糖尿病（T1D）的常见微血管并发症之一，有15%~25%的1型糖尿病最终发展为1型糖尿病肾病（T1DN）^[1]。T1DN是青少年末期肾病的主要类型，主要临床特征为尿蛋白异常、肾脏损伤、肾间质纤维化和肾小球硬化等^[2]。肾间质纤维化形成与成纤维细胞有关，而肾小球上皮细胞的间充质转化是受损的肾产生成纤维细胞，并且最终导致肾纤维化的关键因素^[3]。因此，基于T1DN的发病基质，寻求新型有效的预防和治疗药物来抑制T1DN的发生发展具有深远意义。

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，其化学名为3，3，4，5，7-五羟基黄酮，广泛存在于蔬菜、水果等植物中^[4]。槲皮素的主要药理作用为抗炎、抗氧化、免疫调节及心血管保护等作用^[5]。研究表明，槲皮素可降低DN大鼠的血糖，改善DN的发展^[6]。然而，槲皮素对T1DN的作用以及机制研究尚少。

本研究采用链脲佐菌素构建T1DN大鼠模型，检测槲皮素对血糖和肾脏病理学的影响，并探究槲皮素对T1DN大鼠肾脏肾小球上皮细胞的间充质转化及肾间质纤维化影响，为临床患者的治疗提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

SPF级的雄性SD大鼠30只[北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（鄂）2019-0023]，12周龄，体质量（230±10）g。所有大鼠均饲养于恒温（25±2）℃，湿度50%~60%的无特殊病原体环境中，并可随意进食高压灭菌的水和饲料。本实验方案通过郑州大学实验动物中心伦理委员会的审核，并且在国家卫生研究所关于保护和使用实验动物的方针指导下进行。

1.2 实验试剂

槲皮素（丽珠集团利民制药公司）；尿蛋白试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）；福尔马林（济南百博生物技术股份有限公司）；戊巴比妥钠（上海信裕生物科技有限公司）；Weigert铁苏木素染色液（北京博润莱特科技有限公司）；Trizol试剂、RIPA缓冲液、PMSF、BSA和BCA试剂（上海碧云天生物技术有限公司）；PrimeScript TM RT试剂盒（Takara Biotechnology）；SYBR-Green qPCR Master Mix（北京康润诚业生物科技有限公司）；兔抗鼠转化生长因子-β（TGF-β）、smad2/3、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Snail、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单分子抗体（Abcam）；山羊抗兔二抗（赛信通生物试剂有限公司）；超敏发光液（北京四正柏生物科技有限公司）。

1.3 实验方法 1.3.1 实验动物分组和建模

随机将30只SD大鼠分为3组：对照组、T1DN组和槲皮素组，每组10只。SD大鼠在动物房适应饲养1周后，T1DN组和槲皮素组单次空腹腹腔注射100 mg/kg链脲佐菌素。48 h后尾静脉采血测血糖，血糖含量≥16.7 nmol/L，认定为糖尿病模型构建成功^[7]。大鼠糖尿病建模4周后，收集其24 h尿液并测定尿蛋白，为T1DN建模成功。本实验30只SD大鼠血糖含量均≥16.7 nmol/L，尿蛋白＞30 mg/24 h，成模率100%。槲皮素干预浓度参考文献，选取100 mg/kg，每次灌胃前将槲皮素与生理盐水涡旋成槲皮素混悬液^[8]。血糖检测完毕后，槲皮素组按100 mg/kg槲皮素混悬液灌胃，每日1次。对照组和T1DN组每日灌胃等量生理盐水，连续8周。最后一次灌药结束后收集24 h尿液。在所有大鼠处死之前检测大鼠空腹血糖值，安乐死大鼠后，原位灌洗肾脏后，去除包膜，滤纸吸干后，沿着肾门沿冠状面破开，一半放入福尔马林中固定，通过常规脱水、浸蜡、包埋及切片，另一部分放入液氮中冻存。

1.3.2 24 h尿蛋白检测

收集所有大鼠24 h的尿后，记录尿量。采用尿蛋白试剂盒（比色法）检测尿蛋白的浓度，24 h尿蛋白=尿蛋白浓度×24 h尿量。

1.3.3 天狼星红染色

所有大鼠肾脏5 μm石蜡切片，脱蜡至水化，Weigert铁苏木素染色液染色10 min后，生理盐水冲洗。天狼星红染液染色1~2 h，生理盐水浸泡，脱水，透明，封片后，在光学显微镜下观察各组大鼠肾组织的病理学变化。

1.3.4 实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）检测

取所有组大鼠肾脏组织0.5 mg，放入低温匀浆机100 Hz匀浆10 min后，使用Trizol试剂提取总RNA。用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的纯度和浓度后，通过PrimeScript TM RT试剂盒逆转录合成cDNA（反转录条件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min）。在ABI 7500实时PCR系统上，实时荧光定量PCR实验。PCR扩增条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共计40个循环。以GAPDH作为mRNA的标准内参基因表达结果均以2^-ΔΔct进行统计。目的基因及参考基因序列见表 1。

1.3.5 蛋白质免疫印记法（Western blot）检测

所有组大鼠肾脏组织0.5 mg放入低温匀浆机100 Hz匀浆10 min后，RIPA缓冲液和PMSF抑制蛋白降解液（100∶1）将样本裂解后提取各组总蛋白。通过BCA试剂检测蛋白质的总浓度，将各组的总蛋白浓度调为一致，将其于100 ℃进行变性后保存至-20 ℃。SDS-PAGE电泳分离总蛋白后，将其转膜至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，将其放入对应的一抗（TGF-β、Smad2/3、α-SMA、Snail、E-cadherin和GAPDH）和一抗稀释混悬液（1∶1 000）中，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，放入二抗和二抗稀释液（1∶4 000）混悬液中，室温孵育2 h。TBST洗涤3次，每次10 min，将超敏发光液ECL滴在膜上，放入化学发光成像仪（Invitorgen，美国）进行蛋白显影。通过Image J软件进行分析，相对蛋白表达以GAPDH标准化。

1.3.6 统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行数据分析，GraphPad Prism Version 7.0计量作图，资料以均数±标准差（x±s）表示，多组数据见的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 大鼠空腹血糖值以及24 h尿蛋白的变化

与对照组空腹血糖值（3.82±0.28）nmol/L比较，T1DN组空腹血糖值（23.25±1.88）nmol/L显著增加（P＜0.01）。与T1DN组比较，槲皮素组空腹血糖值（10.57±1.01）nmol/L显著降低（P＜0.05）。与对照组的24 h尿蛋白[（41.33±2.64）μg/24 h]比较，T1DN组24 h尿蛋白[（231.42±5.32）μg/24 h]显著增加（P＜0.01）。与T1DN组比较，槲皮素组24 h尿蛋白[（73.72±2.51）μg/24 h]显著降低（P＜0.05）。见图 1A和1B。

2.2 大鼠肾脏病理变化

天狼星染色结果显示，对照组大鼠的肾小球和肾小管结构完整，肾小管间质未见胶原纤维沉积。T1DN组肾小球增生，肾小管上皮损伤，肾小管间质胶原纤维沉积明显。槲皮素组大鼠的肾小管结构较完整，肾小球肥大程度减轻，肾小管间质胶原纤维沉积明显降低，见图 2。

2.3 大鼠肾组织中肾小管上皮细胞间质转分化标志物的变化

Western blot和qPCR结果显示，与对照组比较，T1DN组的α-SMA、Snail蛋白和mRNA表达显著增加（P＜0.05或P＜0.01），E-cadherin的蛋白和mRNA表达显著减少（P＜0.05或P＜0.01）。与T1DN组比较，槲皮素组的α-SMA、Snail蛋白和mRNA表达显著减少（P＜0.05），E-cadherin的蛋白和mRNA表达显著增加（P＜0.05）。见图 3和表 2。

2.4 大鼠肾组织中TGF-β/Smad信号通路的变化

Western blot和qPCR结果显示，与对照组比较，T1DN组的TGF-β、Smad2/3蛋白和mRNA表达显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。与T1DN组比较，槲皮素组的TGF-β、Smad2/3蛋白和mRNA表达显著减少（P＜0.05）。见图 4和表 3。

3 讨论

中国是全世界糖尿病发病的第一大国，超过一半的糖尿病患者会发展成DN ^[9]。DN的基本机制是细胞内途径的促炎因子和促纤维化因子产生，引起肾损伤和纤维化的过程，并且细胞外基质代谢不正常，在间质内异常积聚^[10]。研究表明，肾小管上皮细胞间质转分化的异常导致纤维细胞增加，进而引起蛋白尿和肾小球纤维化，最终发展成终末期肾病，即T1DN^[11]。本研究采用一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型，12周后，糖尿病大鼠的24 h尿蛋白和空腹血糖明显增加，肾脏主要的病理变化为肾小球肥大，肾小管扩张和间质胶原纤维沉积增多和基底膜不规则增厚，符合T1DN早期功能和结构的改变，说明实验造模成功。研究表明，慢病肾间质纤维化疾病中，有36%肾间质成纤维细胞是来自肾小管上皮细胞转分化^[12-13]。因此，阻碍肾小管上皮细胞间质转分化对T1DN的发生发展具有重要临床意义。α-SMA是肌成纤维细胞的标志蛋白，在纤维化早期高表达，与肾纤维化呈正相关^[14]。Snail属于锌指蛋白家族，能促进肾小管上皮细胞间质转分化^[15]。Snail直接抑制靶基因E-cadherin的表达，进而启动上皮细胞间质转分化^[16]。本研究结果表明，T1DN模型大鼠的α-SMA和Snail表达明显增加，而E-cadherin的表达受到抑制。综上所述，本研究的T1DN构建成功。

槲皮素存在100多种中药草中，对多种疾病具有预防和治疗作用，其中对DN有较好的效果，但作用机制尚不明确^[6]。本研究结果显示，槲皮素干预8周后，大鼠血糖和尿蛋白明显降低，并且肾脏组织病理学形态得到改善，胶原纤维减少。Western blot和qPCR结果显示，槲皮素可抑制T1DN大鼠肾组织中的α-SMA和Snail表达，促进E-cadherin的表达，说明槲皮素可抑制肾小管上皮细胞间质转分化，从而改善T1DN大鼠肾组织纤维化。

研究表明，TGF-β/Smad信号通路是调控上皮间质转化的中心环节，主要是TGF-β激活Smad信号蛋白，从而调节靶基因的转录，促进肾小管上皮间质转分化的α-SMA和Snail表达，抑制标志蛋白E-cadherin^[17]。本研究结果显示，槲皮素可阻碍TGF-β/Smad信号通路的传导，主要是抑制TGF-β、Smad2/3的表达。综上所述，槲皮素可阻断TGF-β/Smad信号的传递，抑制肾小管上皮细胞间质转分化的标志蛋白α-SMA和Snail表达，促进E-cadherin表达，进而改善T1DN的肾损伤，降低血糖和尿蛋白。因此，槲皮素可改善链脲佐菌素诱导的T1DN，有望成为治疗抗T1DN的药物。