糖尿病肾病（DN）是糖尿病患者最常见的微血管并发症，在糖尿病人群中DN患病率约20%~40%^[1]。其病理改变临床常以微量白蛋白尿/蛋白尿、肾功能减退等典型表现。研究发现在DN早期进行有效的治疗，可逆转肾脏损害，减少进入终末期肾病的发生发展^[1]。目前，DN暂时仍没有特效药物，雷帕霉素是一种免疫抑制剂，是DN的常用药，通过与细胞FK506结合蛋白结合后特异性阻断雷帕霉素把分子（mTOR），参与多种免疫抑制达到肾脏保护的作用，但是研究发现雷帕霉素有明显的毒副作用^[2]。在临床实践中，中医药治疗DN体现出比西药更好的优势，可延缓DN的进展。因此，本课题拟通过检测DN模型大鼠结缔组织生长因子（CTGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、骨形态发生蛋白-7（BMP-7）信号通路研究乾坤丹Ⅵ号对DN的作用，明确其治疗作用及机制，为其开发上市中药复方制剂提供基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

清洁级雄性Wistar大鼠40只，体质量（200±20）g，高糖高脂饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司；注射用链佐霉素（STZ，美国Sigma公司，货号S0130）；全蛋白提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号BC3711）；小鼠抗CTGF单克隆抗体（美国SANTA公司，货号sc-373936）；兔抗TGF-β1单克隆抗体（美国Abcam公司，货号ab215715）；小鼠抗BMP-7单克隆抗体（美国SANTA公司，货号sc-53917）；ECL化学发光法检测试剂盒[小鼠免疫球蛋白G（IgG），北京索莱宝科技有限公司，货号SW2010]；总RNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号R1200）；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号RP1100）；PCR引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成，引物序列为：CTGF上游：CACCCGGGTTACCAATGACA、下游：AAGGTTCTGACTCCCGACC，TGF-β1上游：CTCCCGTGGCTTCTAGTGC、下游：GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG，BMP-7上游：GGAAGCGTGCAAGGCATTAG、下游：CTCACCGACCTCTTCTGAGC，β-actin上游：CTGAACGTGAAATTGTCCGAGA、下游：TTGCCAATGGTGATGACCTG。乾坤丹Ⅵ号由天津市北辰中医医院药剂科自行制备。

1.2 实验仪器

罗氏血糖仪，LEGEND MICRO 21R台式高速冷冻离心机（美国THERMO公司），分光光度计（美国THERMO公司），StepOne Software荧光定量PCR仪（美国Applied biosystems公司），BG-subMIDI电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），SDS-PAGE电泳系统（美国BIO-Rad公司），StepOne Software（美国UPV公司）。

1.3 动物模型制备

采用雄性Wistar大鼠40只，随机抽取30只，依照文献方法^[3]，腹腔注射链脲佐菌素（STZ，60 mg/kg），同时给予高糖高脂饲料，建立糖尿病大鼠模型，以造模后1周糖尿病模型大鼠随机血糖≥16.7 mmol/L提示糖尿病模型建立成功；以24 h尿蛋白定量≥30 mg提示DN模型建立成功，成模率在90%以上。并随机分为模型组、乾坤丹Ⅵ号组、阳性对照组，每组10只；其余10只大鼠作为空白对照组。

1.4 药物治疗

试药组灌胃给予乾坤丹Ⅵ号水溶液，通过表观分布容积计算得来，成人用量为每次12 g，每日3次，即每日36 g。成人平均体质量为60 kg，即0.6 g/（kg·d）。大鼠表观分布容积为人的6~9倍，0.6 g/（kg·d）×6=3.6 g/（kg·d）。每日用药量改为3.6 g/（kg·d），阳性对照组灌胃给予雷帕霉素[0.2 mg/（kg·d）]，模型组和空白对照组给于等体积蒸馏水。连续给药12周后处死，采用促凝管腹主动脉取血，取尿液备用，取肾脏并将其分为两部分，一部分4%多聚甲醛溶液固定，另一部分置于液氮之中保存。

1.5 检测指标 1.5.1 血糖检测

1.4中所采集动物血液于半径为13.5 cm离心机中3 000 r/min离心10 min，取上层血清，采用罗氏血糖仪及相应试纸，依照血糖仪说明书方法检测实验动物血清中血糖，以评价糖尿病治疗情况。

1.5.2 尿微量白蛋白检测

使用上文中所采集血清，采用大鼠尿微量白蛋白（mALB）酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（货号ml059011），依照试剂盒说明书方法检测实验动物尿微量白蛋白，以评价肾功能的改变。

1.5.3 肾脏病理检测

取多聚甲醛溶液固定的肾脏组织，脱水、石蜡包埋，切片，并进行苏木精-伊红（HE）染色，于显微镜400倍视野下观察肾小球病理改变情况。

1.5.4 Western blotting法检测CTGF、TGF-β1、BMP-7等因子蛋白的表达

液氮保存的肾脏组织加液氮进行匀浆，加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS），500 ×g离心5 min；吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀；冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10 s）；4 ℃，12 000 r/min离心15 min，离心半径10 cm，收集上清液；BCA蛋白定量法测定蛋白浓度根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样Buffer混合，95 ℃变性10 min，立即置于冰中待用；蛋白上样Buffer将蛋白定量为5 mg/mL，-20 ℃保存备用；将样品加至制备好的SDS-PAGE电泳凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80 V使样品通过浓缩胶与分离胶（电压约8 V/cm）；电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳；凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至PVDF膜。恒压状态下，65 V转膜2 h；将转好的膜（参考目的条带分子量大小）对照marker进行裁剪。小心取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下乳清蛋白封闭1 h，将封闭后的膜分别加入对应的一抗工作液中，4 ℃反应过夜，羊抗兔二抗孵育60 min，洗去游离二抗，使用ELC化学发光成像系统成像。

1.5.5 荧光定量RT-PCR法检测CTGF、TGF-β1、BMP-7 mRNA转录水平

肾脏组织匀浆后，采用总RNA提取试剂盒提取总RNA，使用索莱宝反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA。采用实时荧光定量PCR仪，以20 μL反应体系上样进行PCR反应，以β-actin为内参；反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环；溶解曲线95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s，1循环。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，所有结果以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析法，组间两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 乾坤丹Ⅵ号对DN模型大鼠肾脏病理的改善作用

HE染色结果显示，空白组大鼠肾小球饱满，肾小管上皮细胞排列规则，肾小管结构正常；模型组大鼠肾脏肾小球萎缩、变形，肾小管细胞出现空泡变性；乾坤丹Ⅵ号组与阳性对照组肾脏结构有所好转，损伤减轻。见图 1。

2.2 乾坤丹Ⅵ号对DN模型大鼠血糖和血清微量白蛋白的调控作用

造模12周后，与空白对照组相比，模型组、乾坤丹Ⅵ号组和阳性对照组的血糖、尿微量白蛋白显著升高（P < 0.01），且显著高于阈值（随机血糖≥16.7 mmol/L，24 h尿蛋白定量≥30 mg），提示造模成功。乾坤丹Ⅵ号组与阳性对照组大鼠血糖、尿微量白蛋白显著低于模型组（P < 0.01），且低于阈值。乾坤丹Ⅵ号组与阳性对照组间血糖、尿微量白蛋白无统计学差异（P > 0.01）。见表 1。

2.3 乾坤丹Ⅵ号对糖尿病模型大鼠肾脏组织CTGF、TGF-β1、BMP-7蛋白表达水平的影响

Western blot检测结果显示，与空白对照组相比，模型组、乾坤丹Ⅵ号组和阳性对照组的CTGF、TGF-β1蛋白表达量显著升高，而BMP-7蛋白表达显著下调（P < 0.01），药物治疗后，乾坤丹Ⅵ号组和阳性对照组CTGF、TGF-β1蛋白表达量较模型组显著降低，BMP-7蛋白表达量较模型组显著升高（P < 0.01），且乾坤丹Ⅵ号组CTGF、TGF-β1蛋白表达量较阳性对照组显著降低，BMP-7蛋白表达量较阳性对照组显著升高（P < 0.01）。见图 2和表 2。

2.4 乾坤丹Ⅵ号对糖尿病模型大鼠肾脏组织CTGF、TGF-β1、BMP-7 mRNA转录水平的影响

Real time PCR实验结果显示，与空白对照组相比，模型组、乾坤丹Ⅵ号组和阳性对照组的CTGF、TGF-β1 mRNA转录水平显著升高，而BMP-7 mRNA转录水平显著下调（P < 0.01）；药物治疗后，乾坤丹Ⅵ号组和阳性对照组CTGF、TGF-β1 mRNA转录水平较模型组显著降低，BMP-7 mRNA转录水平较模型组显著升高（P < 0.01），且乾坤丹Ⅵ号组CTGF、TGF-β1 mRNA转录水平较阳性对照组显著降低，BMP-7 mRNA转录水平较阳性对照组显著升高（P < 0.01）。见表 3。

3 讨论

DN早期没有肾脏病方面的症状，甚至尿常规检查也正常，极易漏诊。一旦出现明显的蛋白尿，肾脏的病理损伤已很难逆转。目前对DN的发病机制尚未完全阐明。研究发现足细胞的分化蛋白减少是导致DN持续发展的重要原因^[3]。BMP-7是转化生长因子-β超家族成员，在肾脏发育中起重要作用。BMP-7可部分逆转糖尿病引起的肾脏肥大，恢复肾小球滤过率，使尿白蛋白排泄、肾小球组织学趋于正常。CTGF在肾小管间质损害过程中起重要作用，通过多种途径诱导肾间质纤维化形成和发展，在肾间质纤维化中起重要作用^[4]。研究表明，在DN模型肾组织中，CTGF上调，BMP-7下调；CTGF抑制了BMP-7的表达，且CTGF是治疗DN的重要靶点之一^[5]。TGF-β是一种具有多重生物学效应的细胞因子，参与了多种组织器官纤维化的形成^[6]。TGF-β是CTGF的强效诱导物，CTGF是TGF-β的重要下游介质^[7-8]。CTGF与TGF-β在肾小球病理改变中起到重要作用^[9]。

目前常见的DN动物模型包括自发型、诱发型和转基因动物模型。诱发型2型DN动物模型主要模拟人类2型DN发生发展的过程，其原理为采用高脂、高糖饲料喂养大鼠1个月左右使大鼠产生胰岛素抵抗，腹腔或尾静脉注射STZ破坏大鼠胰岛细胞，使其部分丧失分泌胰岛素功能而模拟2型糖尿病的发生，在糖尿病模型成模后继续喂养4~8周，可出现DN早期特征，且成模率与存活率均 > 90%^[10]。

近年来，中医药治疗DN表现出极大的优势。吕娟等^[11]研究表明，当归黄芪汤可抑制糖尿病大鼠JAK2STAT3信号通路的表达，而该信号通路与氧化应激损伤有关。邓文超等^[3]研究表明，黄芪水煎剂对DN大鼠肾间质Wnt/β-catenin及TGF-β1的表达也表现出抑制作用。宋恩峰等^[12]研究了黄芪对DN大鼠的治疗作用，发现黄芪可治疗DN，其机制可能与降低肾组织CTGF蛋白及其mRNA的过度表达有关。因此，影响TGF-β1、CTGF、BMP-7信号通路可能是黄芪等中药治疗DN的作用机制之一。

乾坤丹Ⅵ号是本院医生根据治疗DN多年临床经验研制的院内制剂。主要由黄芪、天花粉、白茅根、蒲公英、麦冬、玄参等27味药组成。功用健脾化湿行水，固肾养血祛痰；用于脾肾两虚，阴虚火旺型糖尿病并发肾病或单纯尿糖不消者。前期研究表明，乾坤丹Ⅵ号能显著降低DN患者的尿蛋白、血糖、胆固醇、三酰甘油等指标的含量；与西药对比，对DN患者有明显的作用优势，能够显著延缓DN的发展。临床研究表明，与阳性对照组相比，乾坤丹Ⅵ号治疗组治疗后两组患者的空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、胆固醇、三酰甘油、血浆总蛋白的水平间差别均无统计学意义；而24 h尿白蛋白、24 h尿总蛋白含量间差别有统计学意义。说明乾坤丹Ⅵ号对延缓、阻止早、中期DN发展有一定疗效。对耳穴敷贴联合乾坤丹Ⅵ号治疗气阴两虚型早期DN的临床疗效观察也表明，耳穴贴压联合乾坤丹Ⅵ号治疗早期DN（气阴两虚型）临床疗效确切、值得临床上推广使用^[13]。

本研究中，乾坤丹Ⅵ号可显著降低DN模型大鼠血糖，降低血清总蛋白含量，对于DN有一定治疗作用。病理检测结果显示，乾坤丹Ⅵ号治疗组大鼠的肾脏病变有所改善，肾小球萎缩与肾小管纤维化受到抑制。且通过Western blot和PCR检测，结果显示，乾坤丹Ⅵ号可显著升高肾脏组织中BMP-7的转录与表达水平，降低CTGF和TGF-β1转录与表达水平。由于BMP-7对肾损伤有逆转作用，可抑制肾小球损伤。BMP-7水平的升高，提示乾坤丹Ⅵ号对肾脏有一定保护作用。BMP-7的拮抗因子CTGF与TGF-β1在肾小球病理改变中起到重要作用，TGF-β/CTGF是引发肾脏纤维化、肾小球损伤的重要因子。乾坤丹Ⅵ号对这两者的抑制作用，可能也是其治疗糖尿病肾损伤，改善肾小球病理改变的主要机制。本研究结果表明，乾坤丹Ⅵ号发挥对DN的治疗作用可能是通过影响TGF-β1-CTGF-BMP-7轴而发挥作用的。