膝骨性关节炎（KOA）是一种慢性退行性关节病，常表现为软骨下骨质增生硬化、滑膜无菌性炎症、软骨剥脱等特征，导致患者膝关节活动疼痛、僵硬和活动严重受限，其病因病机现尚无统一定论。中医药治疗KOA，更具简便效廉之优，减轻患者经济负担，提高生活质量，缓解临床症状^[1]。

KOA属“痹证”“骨痹”范畴，肝肾不足则风寒湿之邪易于侵入，气机运行不畅，日久则气血瘀滞而发病，故其病为本虚标实之证，肝肾亏虚为本，气滞血瘀为标，临证亦以肾虚血瘀最为常见^[2]。清代赵竹泉所著《伤科大成》中补肾活血汤（BHD）由熟地黄、当归尾、没药、山茱萸、菟丝子、破故纸、杜仲、枸杞子、肉苁蓉、红花和独活11味药组成，可达补肾壮筋，活血止痛之效。因其成分较为复杂，治疗KOA机制仍需探索。网络药理学作为中医药研究的一个新兴领域，通过构建“药物- 成分-靶点”网络，探讨药物与机体的作用^[3]。文章旨在通过网络药理学方法，挖掘分析BHD治疗肾虚血瘀型KOA的具体有效化学组分和药效靶点，筛选主要靶点与通路深入探析，并对此方治疗KOA作用机制予以进一步明确，以作为临床用药的有效参考。

1 材料与方法 1.1 补肾活血汤主要作用靶点和相关疾病靶点的收集

通过Swiss Target Prediction搜索BHD的中药，按照以下筛其主要活性成分靶点：一是口服生物利用率高于30%；二是药物相似性须高于0.18。运用GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库检索与KOA基因相关的数据资料。经相互分析后，得出BHD与KOA的共同靶点蛋白。

1.2 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络、药物-成分-靶点图的构建

根据得出的结果，继而使用Cytoscape3.6.1结合STRING数据库构建出网络药理学分析研究所需的药物—成分—靶点网络。

1.3 靶点通路分析

将靶点结果输入DAVID数据库，通过输入靶基因名称列表并选定物种为“homo sapiens”，点击Custom analysis设置参数分析，进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）与基因功能（GO）富集分析。

1.4 分子对接

分子对接处理是分析药方对病症的具体干预机制。将药物靶点化合物按其度值排序，选其度值前10位的化合物，依下流程与肿瘤坏死因子（TNF），蛋白激酶B1（AKT1），人磷酸肌醇-3-激酶催化亚基G肽（PIK3CG）等相关的蛋白进行分子对接操作。

1.4.1 对小分子及蛋白处理

单体小分子化合物首先使用Syby12.0软件进行模拟构建和结构的能量优化，结果存储为mol2格式文件。在蛋白数据库（PDB）下载TNF，PIK3CG，AKT1蛋白晶体结构，蛋白ID为3KMC，6AUD，6HHI，并在Syby12.0中将蛋白分为有配体和无配体两种类型，其分类结果分别存储为PDB格式文件。

1.4.2 进行分子对接操作

该操作涉及LGA遗传算法，应用软件AutoDock4.2。

首先通过该软件打开无配体蛋白PDB文件，模拟加入电荷以确定各个蛋白晶体具体结合域，设置xyz轴规格均为40格点的结合晶格。导入生成的mol2格式文件并生成pdbqt文件，基于该文件在结合晶格处与蛋白用遗传算法虚拟对接操作。其运行次数设置为30轮次，小分子旋转键扭转及四元数的次数均为30，其他使用软件默认设置。

1.4.3 对接结果分析

将对接结果按照结合能绝对值的大小由高到低排序，选择其中绝对值最高的构相，使用Pymol软件模拟可视分析其具体的结合位点并保存操作结果。

2 结果 2.1 药物-化合物-靶点网络

将上述分析得出的82种主要活性化合物使用Swiss Target Prediction数据库预测其主要活性成分调控靶点，将其重复部分去除，最终筛选出靶点数量为615个。续用Cytoscape生成“药物—成分—靶点”网络，具体结果如图 1所示，该网络有1 993条边及669个节点。

表 1列举了对该网络进行拓扑分析的参数设置，其目的是为了明确各个活性成分调控的作用程度，对应的靶点边数越多则调控程度越高。其排名前10的成分为蛇床子素、川白芷素、二氢山芹醇醋酸酯、伞形酮等为BHD的主要活性成分。

2.2 预测补肾活血汤治疗膝骨性关节炎的靶点

根据GeneCards数据库对KOA的治疗靶点检索，设置相关性大于5的条件进行筛选，得到564个相关靶点数量，再用Venn平台将KOA靶点与BHD靶点进行交集筛选，最终得出总数为82的靶点集合，见图 2。

2.3 补肾活血汤与膝骨性关节炎蛋白质相互作用核心网络的构建

将上述82个靶点在STRING平台上进行PPI网络分析，核心网络图（图 3）包含918条边，节点数为82个，其中节点表示蛋白，每条边即代表两个蛋白之间存在相互作用，关联度与线条数量成正比；该网络中靶蛋白节点度均值22.4，其中有36个靶蛋白节点度均超过均值，这些靶蛋白可视为关键靶点，也是BHD的调节作用来源。表 2中将排名前20的关键靶点进行排序，其中TNF、转录激活因子3（STAT3）、丝裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1）等多个靶点均与炎症性疾病有高度关联。

2.4 补肾活血汤靶点通路分析

在DAVID数据库中使用以上分析得出的82个靶点进行GO富集分析与KEGG通路注释，得出分子功能、生物过程和细胞成分的GO条目与富集通路数量分别为119个和95条，根据以上结果得出图 4中所示的TOP10富集柱状图，为GO富集到药物所调节的相关生物功能。GO功能富集主要涉及凋亡信号途径、外部刺激反应的正向调节、炎症反应等。KEGG通路分析按照P值排列前20通路分析后发现，KEGG通路主要参与调控TNF信号通路，缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路，类风湿性关节炎，破骨细胞分化，PI3K-Akt信号通路等。见图 5。其中主要通路涉及的相关靶点为TNF，AKT1，MAPK1，MAPK14，PI3KCG等。BHD的成分靶点与KEGG通路交互网络寻找主要的蛋白靶点，见图 6，KEGG通路中与KOA相关的通路主要涉及TNF，类风湿性关节炎，破骨细胞分化，PI3K-Akt信号通路，对通路中靶点进行PPI网络分析，见图 7，按照P值排列，TNF信号通路排第一位，通路中涉及的靶点主要如表 3所示。通过STRING分析平台，将TNF信号通路中的靶点进行PPI交互网络的构建，见图 8，得到通路中的TNF，PIK3CG，AKT1的相关性较好，因此将进一步选取前10个主要成分对炎症靶点进行分子对接验证。

2.5 分子对接

分子对接验证中，结合能数值如表 4所示，药物的主要成分中：蛇床子素，川白芷素，藁本内酯，伞形酮及阿魏酸等，与AKT，TNF，PI3KCG的对接效果较好。显示BHD的主要成分具有潜在调节炎症靶点的作用，起到抗炎作用。主要成分与AKT，TNF，PI3KCG的对接3D图谱如图 9~11所示。

3 讨论

KOA应用中医药治疗研究取得了一些重要进展，对指导与改善中医药临床应用有着积极的作用。KOA核心病机以肝肾亏虚为本，气滞血瘀为标，肾虚血瘀为主贯穿始终，BHD以补肾壮筋，活血止痛为主，对肾虚血瘀型颇具良效。《灵枢· 刺节真邪》言：“虚邪之中人也……其入深，内搏于骨，则为骨痹……留而不去，则痹。”阐明肾主骨生髓，为先天之本；若先天禀赋不足，或后天耗损太过，则精不足，精不足则无以化生气血，肾亏髓少，则气虚血瘀，筋脉淤阻，内博于骨，则发骨痹。肾主藏精，在体合骨，故肾精亏虚，骨失所养，可致腰膝酸痛。《黄帝内经》曰：“气行则血行，气滞则血瘀。”气机运行不畅则脉道不利，不通则痛，言膝痹之标在于血瘀，故治疗肾虚血瘀型KOA当以补肾活血为大法。据此提出使用《伤科大成》补肾活血汤治疗，直指根本。多项研究表明，补肾活血的中药具有明确的降低血清、关节软骨及滑膜部位的NO含量，以及减少脂质过氧化的程度，从而达到缩短病程、保护软骨细胞和降低退行性病变速度的作用。

通过应用网络药理学方法，提取出BHD中482种疾病基因和533个药物靶点，将其与KOA疾病靶点数据库进行交集从而得出82个有效靶点，使用PPI网络结合STRING平台进行分析并得出关键靶蛋白共36种，靶蛋白平均节点度值为22.4，包括TNF、AKT1、MMP9、IL1B、PTGS2、CASP3、MMP2、MAPK8等。再对以上关键靶点构建分析网络，以蛇床子素、川白芷素、二氢山芹醇醋酸酯、伞形酮、阿魏酸松柏酯、东莨菪亭、洋川芎内酯A、阿魏酸、佛手苷内酯、藁本内酯为度值排名前10成分。现代药理学研究发现以上化合物抗菌、抗氧化、镇痛抗炎活性、抗老化、舒张血管及抗微生物活性等作用明显^[4]。蛇床子素是抗炎镇痛主要成分，能够有效地改善骨代谢水平^[5-7]，通过抑制IL-1β等炎症介质的释放发挥保护KOA软骨组织的作用，可作为下游靶点的调控分子调控机体的炎性反应，降低PI3KCG/AKT信号通路关键蛋白PI3KCG、AKT蛋白的表达^[8]；通过抑制MAPK的磷酸化和MMP活性，从而抑制TNF基因的表达，达到治疗KOA的作用^[9]。川白芷素对内毒素诱导的巨噬细胞有一定阻断作用，从而发挥一定的抗炎功效。Ouyang等^[10]研究表明，伞形酮治疗OA疗效显著，通过抑制MAPK信号通路可能是其治疗OA的潜在靶点。东莨菪亭可通过MAPK信号通路抑制IL-6的产生而达到改善软骨降解、软骨细胞存活、软骨内稳态和软骨下骨结构的完整性，从而减轻KOA的进展和关节软骨结构。佛手苷内酯可通过减轻磷酸三钙磨损颗粒诱导的内质网应激及PERK通路活化而阻止骨细胞凋亡^[11]。研究表明，洋川芎内酯A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、阿魏酸等化合物与抗血小板聚集活性相关性大，有效促进新血管形成有效物质，舒张血管。藁本内酯还可通过抑制癌细胞生长、血管平滑肌细胞过度生长达到镇痛消炎作用^[12]。以上表明BHD可能通过本次筛选的主要药物成分作用于AKT、TNF、PI3KCG等靶点达到治疗KOA，分子对接结果亦显示上述化合物潜在调节炎症靶点的作用，保护软骨及其环境，改善骨代谢，改善血流动力，改善微循环，从而达到补肾活血之效。

KOA的发病机制是由于关节内环境发生变化，存在过多的炎症因子而诱发，其治疗思路在于调节关节内的炎症因子浓度^[13]。根据GO富集分析生成的119个GO条目的结果，证明BHD中的活性成分可以在人体细胞质、细胞液、微绒毛等多处细胞部位对炎症反应起到调控作用，其涉及过程包括细菌防御反应、信号通路刺激或阻断等。据KEGG富集分析的结果，BHD治疗KOA的关键靶点数量为36，其涉及到的信号通路主要包括TNF和HIF-1信号通路，类风湿性关节炎，破骨细胞分化，PI3K-Akt信号通路等信号通路。Sandra等^[14]研究发现TNF因子过量可激活胰蛋白酶原，继而对软骨细胞形成过度刺激从而导致软骨部位发炎坏死，可刺激滑膜周围血管导致滑膜腺体萎缩而导致关节肿胀间接影响KOA的发生。Wang等^[15]研究使用IL-1Ra和可溶性的TNF受体，可协同抑制TNF-α从而延缓关节炎的发展。HIF信号通路是低氧反应信号之一，通过诱导产生HIF-1α并激活下游相关的基因，刺激破骨细胞分化而引起KOA；PI3K-AKT信号通路亦可促进HIF-1的表达及其稳定^[16]。Li等^[17]研究表明MAPK信号通路的激活与OA中软骨细胞凋亡、炎症及胶原蛋白降解过程相关；亦可通过介导调控骨性关节炎软骨病变的信号转导系统，其相关信号通路的激活可改变基质金属蛋白酶的表达，诱导MMP-13的表达，导致软骨特性的Ⅱ型胶原进行性降解，从而调控软骨细胞的细胞凋亡及骨破坏等一系列反应，影响KOA的发生与发展，并调节细胞的炎性反应^[18-19]。PI3K-AKT信号通路由多种因素激活，并参与多种下游细胞因子、炎症介质如TNF-α等的基因转录^[20]，对于关节炎症有激发和加重的作用。在大量软骨细胞发生损伤时，PI3K激活并令AKT磷酸化，阻止软骨细胞的凋亡过程，达到对KOA的治疗作用^[21]。由此推测，BHD可能通过活性成分作用于TNF，AKT1，MAPK等关键靶点，激活或抑制TNF，破骨细胞分化，PI3K-Akt等多条信号通路，通过调节细胞代谢、增殖与凋亡和促进血管生成等过程，达到提高免疫力、逐步改善关节内环境和抑制炎症的目标，达到治疗效果。

综上所述，文章通过研究，将大量的数据使用网络药理学方法整合与分析，应用分子对接技术对其靶点进行验证，构建BHD治疗KOA的靶点交互作用的网路图，将现代医学方法与中医整体观契合，为中医药的发展研究开辟新思维。网络药理学作为近几年来中医药研究的一个新兴领域，将传统中医复方通过多学科交叉研究，构建“药物-成分-靶点”网络，探索药物与机体相互作用的途径。微观水平阐明BHD通过多靶点、多通路从抗炎、抗氧化、调节细胞增生、细胞凋亡及新血管生成等方面发挥治疗KOA的潜在机制，为BHD的临证提供微观依据。后续可深入研究BHD中药的化学成分复杂性，应用具有高分离、高分辨的高效液相色谱仪，并对中药的提取物成分进行定性鉴定，为复方中药中所含化学成分进行鉴别。应用液质联用定性分析方法，可进一步验证复方中的活性成分和全定性分析思想实际的可行性，为阐明中草药的物质基础提供有力支持，可更深层次验证网络药理学中所筛选出的药效靶点成分^[22-23]。