多囊卵巢综合征（PCOS）是一种内分泌代谢异常的综合性疾病，主要发病人群为青春期和育龄期女性，占育龄妇女的6%~20%，该病是导致患者不孕的主要原因，给患者及其家庭带来了沉重的心理负担^[1]。PCOS因其有临床症状特异、病因复杂、影响因素多样的特点，其发病机制至今仍不明确，但研究证实该病不仅是最常见的妇科内分泌疾病外，还是一种以肥胖、胰岛素抵抗等为特点的代谢性疾病，影响患者一生^[2]。中医理论认为，肥胖患者因长期饮食肥甘厚腻，使之痰浊内生、湿浊内停，故肥胖患者多痰湿，而有机阴离子转运多肽4a1（oatp4a1）作为机体关键的膜转运蛋白，在维持机体内外水液代谢平衡中发挥着重要作用，可高效运转毒素、食物和药物等代谢产物、内分泌产物等“湿浊”，故可推测其可能在PCOS中扮演重要角色^[3]。PCOS作为一种代谢综合征，其代谢紊乱普遍存在，而PCOS患者代谢紊乱主要表现为糖脂代谢紊乱，故如何改善其糖脂代谢紊乱一直是临床工作的重中之重^[4]。近年来随着中国测序技术的不断发展，研究发现肠道菌群的变化与人类多种代谢性疾病的发生、发展密切相关，PCOS也不例外，因此近年来其已经成为医学领域的研究焦点及热点^[5]。而苍附导痰汤是治疗形肥痰盛的经典方剂，具有健脾行气、化痰燥湿之功效，且已有研究证实其在PCOS治疗方面具有显著效果^[6]，但作用机制尚不明确。因此本文就苍附导痰汤对多囊卵巢综合征大鼠oatp4a1、代谢紊乱与肠道菌群的影响进行研究探讨，为临床预防及治疗PCOS提供参考。

1 材料与方法 1.1 动物材料

本实验选取南京君科生物工程有限公司提供的50只SPF级SD雌性大鼠[合格证书为：SCXK（苏）2019-0005]，平均体质量190~250 g，大鼠单笼喂养，室温生长，模仿昼夜交替，昼夜各12 h，在常温下进行无菌自由进食、饮水2周，按照《实验动物管理条例》规定进行实验。实验方案获得天津中医药大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准（伦理审批号：20210314）。

1.2 实验材料

脱氢表雄酮（DHEA）（货号：E03788，上海瓦兰有限公司）；苍附导痰汤（本院自制，为水煎剂，生药含量为0.86 g/mL）；苏木素染液（货号：H9627，美国Sigma公司）；伊红染液（货号：AG1100-100 mL，上海吉至有限公司）；光学显微镜（型号：CX-60，日本OLYMPUS公司）；免疫组化试剂盒（货号：YDDEF001，上海羽哚有限公司）；oatp4a1抗体（货号：BMP088，山东华博基因工程有限公司）；血糖仪（型号：KQT-6型，北京安腾有限公司）；放射免疫试剂盒（货号：SHXFFMDC01，上海信帆有限公司）；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号：446502，美国R & D公司）；多功能酶标仪（美国Molecular D evices公司，型号：BX-53）；肠球菌选择性培养基（货号：028961，广东环凯有限公司）；肠杆菌选择性培养基（货号：028700，广东环凯有限公司）；乳酸杆菌选择性培养基（货号：PJ0458，北京普非有限公司）；双歧杆菌选择性培养基（货号：GRP0289，上海广锐有限公司）。

1.3 实验步骤 1.3.1 造模

选取40只SPF级SD雌性大鼠，于背部皮下注射5 mg/100 g DHEA，每日1次，且每日以特制高脂饲料进行喂养，连续30 d，在建模15 d后，开始对大鼠进行连续阴道涂片用以观察其动情期，当大鼠阴道上皮细胞持续角化，始终处于动情间期，失去规律的动情周期变化时，则视为造模成功，造模过程中无大鼠死亡，全部造模成功。

1.3.2 分组及给药

从造模成功的大鼠中随机选取30只，将其分为模型（M）组，低剂量苍附导痰汤（D）组，高剂量苍附导痰汤（H）组，每组10只，同时选取剩余正常大鼠10只作为正常（N）组，对D组灌胃1.42 g/kg苍附导痰汤，对H组灌胃5.68 g/kg苍附导痰汤，两组均每日1次，连续2周，N组、M组同期给予同体积生理盐水灌胃。从第6天开始，每天8：00、15：00、22：00对4组均进行阴道涂片，持续15 d，观察并记录大鼠动情期、动情前期。

1.3.3 标本采集

实验完成后，收集新鲜粪便样本置于灭菌的离心管内，于-80 ℃冰箱保存，然后禁食12 h，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉处死并称质量，取出双侧卵巢组织称质量，按照公式计算，卵巢指数=两侧卵巢总质量（mg）/大鼠体质量（g），固定、洗净后放入冰箱密封保存，同时腹主动脉取血，在4 000 r/min条件下离心10 min，离心半径10 cm，取上清液，放入-80 ℃冰箱中密封保存。

1.3.4 苏木精-伊红（HE）染色法检测卵巢组织病理形态

取右侧卵巢，进行常规石蜡包埋、切片，60 ℃烤箱中1 h行微波抗原修复，脱蜡、透明、脱水，蒸馏水清洗1 min，用苏木素染液进行HE染色，中性树胶封片后，用光学显微镜进行组织病理学观察。

1.3.5 免疫组化法检测oatp4a1蛋白表达

取左侧卵巢，进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水化处理后，用过氧化氢温室孵育10 min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3次，微波热修复后，在37 ℃，2% BSA条件下封闭30 min，加入稀释的oatp4a1一抗（1∶100），4 ℃摇床振荡孵育过夜后洗膜，加入稀释的生物素标记的二抗（1∶100），37 ℃轻摇室温孵育30 min洗膜，用二氨基联苯胺（DAB）进行显色，显色完成后，PBS洗涤3次，苏木精复染5 min，中性树胶封片后，用光学显微镜进行观察。

1.3.6 代谢紊乱相关指标检测

取各组大鼠血清，血糖仪检测空腹血糖（FBG），严格按照仪器说明说进行检测；放射免疫试剂盒测定空腹胰岛素（FINS），严格按照试剂盒说明书进行检测，当检测完成后，测定放射性强度，绘制标准曲线并计算其含量；ELISA试剂盒检测脂联素（APN），严格按照试剂盒说明书进行检测，检测完成后，立即在波长450 nm处用酶标仪，测定每孔吸光度，绘制标准曲线并计算其含量；并按公式[胰岛素抵抗脂数（HOMA-IR）=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）÷22.5]计算胰岛素抵抗指数。

1.3.7 肠道菌群检测

取各组大鼠粪便（每次取0.1 g），用生理盐水稀释100倍，然后进行10倍系列稀释，稀释为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释液，采用微量加样器吸取10^-3、10^-4、10^-5稀释程度的标本滴加至肠球菌选择性培养基，吸取10^-3、10^-4、10^-5稀释程度的标本分别滴加至肠杆菌选择性培养基、乳酸杆菌选择性培养基、双歧杆菌选择性培养基，肠杆菌及肠球菌在37 ℃、需氧条件下培养24 h，乳酸杆菌及双歧杆菌在37 ℃。厌氧条件下培养48 h，培养完成后，用平板菌落计数法计算各个稀释平板内的菌落数，计算结果以对数形式表示。实验在天津中医药大学实验室进行，实验室等级为1级生物安全防护实验室，实验时注意事项：1）检测需要无菌操作。2）每次检测都需要阴性对照。3）注意观察气体是否排完全。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism8.0对各组大鼠oatp4a1、代谢紊乱与肠道菌群相关指标进行统计分析，实验数据采用均数±标准差（x±s）多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠动情期及卵巢指数结果

与N组比较，M组大鼠动情前期、卵巢指数明显升高（P＜0.05），动情期明显降低（P＜0.05），与M组比较，D组、H组大鼠动情前期、卵巢指数显著降低（P＜0.05），动情期显著升高（P＜0.05），且H组比D组变化明显（P＜0.05）。见表 1。

2.2 各组HE染色结果

N组大鼠卵巢组织及卵泡生长正常，可见多个黄体和不同发育时期卵泡，且间质正常，间质中可见深染的肥大细胞，M组大鼠可见卵巢皮质呈多囊样改变，黄体数量明显减少，可见较多的闭锁卵泡，卵泡细胞多为坏死、增厚，D组、H组大鼠卵巢病理显著改善，黄体数量逐渐增多。见图 1。

2.3 各组大鼠oatp4a1蛋白表达结果

大鼠卵巢组织oatp4a1蛋白表达量分别为N组（2.33±0.21）、M组（1.14±0.11）、D组（1.68±0.15）、H组（2.24±0.19）（F=15.870，P＜0.001），与N组比较，M组大鼠卵巢组织oatp4a1蛋白表达显著降低（P＜0.05），与M组比较，D组、H组大鼠卵巢组织oatp4a1蛋白表达明显升高（P＜0.05），且H组比D组显著升高（P＜0.05）。见图 2。

2.4 各组大鼠代谢紊乱相关指标结果

与N组比较，M组血清中FBG、FINS、HOMA-IR显著升高（P＜0.05），APN显著降低（P＜0.05），与M组比较，D组、H组血清中FBG、FINS、HOMA-IR显著降低（P＜0.05），APN显著升高（P＜0.05），且H组比D组变化显著（P＜0.05）。见表 2。

2.5 各组大鼠肠道菌群结果

与N组比较，M组大鼠肠杆菌数量显著升高（P＜0.05），肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量明显降低（P＜0.05），与M组比较，D组、H组大鼠肠杆菌数量显著降低（P＜0.05），肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量明显升高（P＜0.05），且H组比D组变化显著（P＜0.05）。见表 3。

3 讨论

PCOS是临床常见疾病，近年来随着人们生活方式的不断变化，该病的就诊率不断增高，且正在向年轻化发展，因此早预防、早诊断、早治疗就显得尤为重要，这将对提高患者生存质量，降低家庭及社会负担具有积极意义^[7]。而近年来研究发现，中医药在治疗PCOS方面发挥重要作用，故中医药越来越受到广大医学专家的重视^[8]。因此，文章就苍附导痰汤对多囊卵巢综合征大鼠oatp4a1、代谢紊乱与肠道菌群的影响进行研究探讨，为临床治疗PCOS提供理论基础。

本研究发现，苍附导痰汤可有效改善大鼠动情周期及卵巢病理形态，降低卵巢指数，并促进oatp4a1蛋白表达，疗效显著。PCOS在中医中虽无具体名称，但根据其疾病特征可归属于中医“闭经”“月经过少”“不孕”“月经后期”等范畴，中医认为该病病机在于肾虚、脾虚、肝郁、痰湿等，故治疗多以补肾调经、补气健脾、疏肝解郁、燥湿化痰为主^[9]。众所周知，肥胖是PCOS的典型特征，其可使患者病程持续加重，而肥胖的病理基础是水液代谢平衡紊乱导致的痰湿，因此如何改善机体水液代谢是近年来医学领域关注的焦点之一^[10]。oatp4a1是溶质载体超家族的重要成员，可高效运转多种异体代谢产物，在维持机体水液代谢平衡方面发挥重要作用，研究发现，其功能失调可引起“痰浊”的分布、吸收以及排泄障碍，从而导致多种疾病的发生，PCOS也不例外，故其越来越受到临床的重视^[11]。苍附导痰汤来源于《叶天士女科诊治秘方》，方中香附、苍术为君药，具有健脾燥湿、疏肝解郁、行气宽中，共奏调和肝脾之功；茯苓健脾渗湿，助脾运化水湿，使之无以生痰，陈皮、枳壳理气行滞，以助健脾消痰，胆南星清热化痰，以治痰瘀化热，共为臣药；生姜、神曲为佐药，温中化痰、消积导滞；甘草健脾益气祛痰，调和诸药，可解半夏、南星之毒，全方共达健脾祛湿化痰之功效，在治疗痰湿型闭经、肥胖方面具有显著疗效^[12]。对于PCOS大鼠，苍附导痰汤通过其健脾燥湿，理气化痰之功效，调节胃肠功能稳态，从而抑制炎症反应、抑制氧化应激、改善机体代谢水平，进而有效促进oatp4a1合成及分泌，达到改善水液代谢平衡的目的，最终有效改善临床症状。

研究结果显示，与M组比较，D组、H组血清中FBG、FINS、HOMA-IR显著降低，APN显著升高，且H组比D组变化显著，这说明苍附导痰汤可显著改善大鼠代谢紊乱。PCOS在生育年龄的早期，主要症状表现为月经紊乱，尤其是月经稀发，高雄激素血症和不孕，然而到生育年龄晚期以及围绝经期，代谢综合征将替代不孕影响33.4%~47.3%的患者，故代谢紊乱已被普遍认为是PCOS的关键病理、生理改变^[13]。而研究表明，糖脂代谢紊乱在PCOS患者中最为常见，其中糖代谢紊乱主要表现为糖代谢异常及胰岛素抵抗，数据显示，胰岛素抵抗存在于50%~80%的PCOS患者，是促进代谢综合征发展的重要因素，故本研究选择FBG、FINS、HOMA-IR作为反映糖代谢水平的指标；APN作为唯一由脂肪组织分泌的蛋白质，其不仅对卵巢功能具有潜在性作用，PCOS患者肥胖、高雄激素血症、脂肪分布异常等也都与其密切相关，故其可作为反映脂代谢紊乱的有效指标^[14-15]。而对于PCOS大鼠，苍附导痰汤可能是通过健脾祛湿化痰功效，来维持机体代谢平衡，从而抑制卵巢雄性激素相关合成酶StAR表达、促进胰岛素信号传递、调控生殖激素分泌，进而改善胰岛素代谢功能、血糖、血脂指标，最终有效改善代谢紊乱及疾病症状。

本文研究表明，与M组比较，D组、H组大鼠肠杆菌数量显著降低，肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量明显升高，且H组比D组变化显著，这说明苍附导痰汤可显著改善大鼠肠道菌群。肠道菌群被称为“被遗忘的器官”，是环境因素影响人类健康以及疾病的重要媒介之一，正常的肠道菌群对维持机体健康极为重要，其可有效抵御病原菌入侵，分解并排出毒害物质，此外其还与机体代谢、内分泌、神经系统关系密切^[16]。近年来国内外研究发现，PCOS患者中存在肠道菌群紊乱，其构成与正常人群具有显著差异，肠杆菌数量有下降趋势，肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌有上升趋势，这提示其可能在PCOS发生、发展中发挥重要作用，且还可能是引起胰岛素抵抗的主要因素^[17]。而对于PCOS大鼠，苍附导痰汤可能是通过改善胃肠道功能，来改善胃肠黏膜通透性，从而维持肠道免疫平衡、抑制炎症反应、抑制内毒素产生等，进而达到改善肠道菌群的目的，最终有效抑制PCOS的发生、发展。

综上所述，苍附导痰汤可显著促进多囊卵巢综合征大鼠oatp4a1蛋白表达，改善大鼠代谢紊乱和肠道菌群。但本研究仍然存在一定不足，比如样本量、研究指标较少，只对oatp4a1蛋白表达进行检测等，研究内容需进一步完善，在今后的研究中应该增加实验样本，通过多元化实验方案为临床治疗提供有力的临床依据。