天津中医药  2023, Vol. 40 Issue (11): 1466-1477

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朱荔炜, 王春国, 洑晓哲, 等.
ZHU Liwei, WANG Chunguo, FU Xiaozhe, et al.
基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS和网络药理学探讨益气祛风方治疗糖尿病肾病作用机制
Mechanism of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of diabetic nephropathy based on UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS and network pharmacology
天津中医药, 2023, 40(11): 1466-1477
Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2023, 40(11): 1466-1477
http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2023.11.19

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收稿日期: 2023-07-16
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朱荔炜, 王春国, 洑晓哲, 等. 基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS和网络药理学探讨益气祛风方治疗糖尿病肾病作用机制[J]. 天津中医药, 2023, 40(11): 1466-1477.
ZHU Liwei, WANG Chunguo, FU Xiaozhe, et al. Mechanism of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of diabetic nephropathy based on UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS and network pharmacology[J]. Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2023, 40(11): 1466-1477.
基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS和网络药理学探讨益气祛风方治疗糖尿病肾病作用机制
朱荔炜1 , 王春国2 , 洑晓哲1 , 黄为钧1 , 李潇然1 , 赵进喜1     
1. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700;
2. 北京中医药大学中药学院，北京 100029
收稿日期：2023-07-16
基金项目：国家自然科学基金面上项目（82074354）；北京市自然科学基金面上项目（7222278）；北京中医药大学科研平台建设项目（2023-JYB-KYPT-14）
作者简介：朱荔炜（1996-），女，博士研究生，主要研究方向为糖尿病及其并发症的中医药防治.
通讯作者：赵进喜，E-mail：zhaojinximd@126.com.
摘要：[目的] 借助超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱仪（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）技术结合网络药理学和分子对接技术，分析益气祛风方防治糖尿病肾病（DN）的物质基础和作用机制。[方法] 采用UHPLC-Q-Ex－active Orbitrap MS鉴定益气祛风方的主要化学成分，采用网络药理学方法构建“主要成分-核心靶点-信号通路”网络，进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，对主要活性成分与核心靶点进行分子对接。[结果] 从益气祛风方共鉴定出115个化学成分，获得40个核心靶点，主要涉及磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、脂质及动脉硬化、糖基化终产物及受体（AGE-RAGE）信号通路、趋化因子信号通路及低氧诱导因子（HIF）1信号通路等。分子对接结果表明生松素、荠苧黄酮、槲皮素、N-乙酰多巴胺二聚体-1、N-乙酰多巴胺二聚体-2等成分与部分核心靶点有较好的结合活性。[结论] 本研究初步鉴定了益气祛风方治疗DN潜在的有效成分并预测了其作用靶点，为进一步研究中医“从风论治”法和益气祛风方治疗糖尿病肾病的作用机制提供了新的思路。
关键词：从风论治    糖尿病肾病    网络药理学    超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱仪    分子对接    

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最常见的微血管并发症之一, 目前已成为全球引起终末期肾脏病的主要原因[1]。发挥中医药的优势, 探索中医药方法治疗DN十分必要。

DN属于“消渴病”并发“水肿”“关格”等疾病范畴。赵进喜教授在继承国医大师吕仁和教授关于DM微血管并发症“微型癥瘕形成”理论的基础上, 通过临床实践与证候学研究, 发现络脉“微型癥瘕”形成的过程中, “风邪”亦为导致DN进展的另一重要致病因素, 因此提出“肾络伏风”致病假说。在此基础上继承前人临床经验和学术思想, 提出“从风论治”DN的治疗思路[2-4], 在临床应用中取得良好疗效。代表方剂益气祛风方具有益气活血、祛风通络的功效, 既往研究发现该治法具有一定的降低蛋白尿、延缓肾小球纤维化的作用, 其机制与调控胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号转导通路、P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路相关[5-8]。由于中药作为天然产物, 活性成分复杂, 干预DN的机制往往是多靶点、多途径的, 因此益气祛风方减少蛋白尿、延缓DN病程进展的机制仍待进一步完善。

网络药理学融合多学科理论和技术, 其整体性、系统性的特点与中医药整体观念原则一致, 可用于研究中药复方多成分、多靶点、多途径协同作用的生物网络关系[9]。本研究采用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱仪（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）技术对益气祛风方中主要化学成分进行快速分析, 基于实测化学成分采用网络药理学研究方法进行靶点预测和功能分析, 通过分子对接技术判断受体-配体结合度, 探讨本方的药效物质和作用机制, 为DN的中医药临床治疗和益气祛风方的实验研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS: 配有热喷雾离子源（HESI）、Xcalibur 4.2化学工作站（美国Thermo Scientific公司）; Vanquish超高效液相色谱系统: 含二元梯度泵, 自动进样器, 柱温箱, DAD检测器（美国Thermo Scientific公司）。Millipore Synergy UV型超纯水机（美国Millipore公司）; KH5200E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）; 十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

益气祛风方药物生黄芪（批号: 20102201）、穿山龙（批号: 00251101）、炒牛蒡子（批号: 2008062）、蝉蜕（批号: 20092401）、鬼箭羽（批号: 19090504）和烫水蛭（批号: 20072001）饮片均购于北京中医药大学东直门医院药房。甲酸、甲醇、乙腈等试剂均为质谱纯（美国Fisher公司）。白细胞介素（IL）-1β（SC-52012）、趋化因子配体5（CCL5）（SC-365826）、核因子-κB（NF-κB）（SC-8414）购于Santa Cruz; IL-6（bs-0782R）、β-actin（bs-0061R）购于Bioss; 辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠免疫球蛋白g（IgG）（SA00001-1）、HRP标记羊抗兔IgG（SA00001-2）购于Proteintech。

1.2 实验动物

6周龄SPF级雄性db/db小鼠及db/m小鼠, 初始平均体质量25 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号: SCXK（京）2016-0006]。

1.3 数据库及软件

PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）; 中药系统药理学分析数据库TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）; SwissADME（http://www.swissadme.ch//）; Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）; 人类孟德尔遗传数据库（OMIM, https://www.omim.org/）; 人类基因数据库（GeneCards, https://www.genecards.org/）; STRING数据库（https://string-db.org/）; Metascape数据库（http://metascape.org/）; RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org）; AlphaFold数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/）; Cytoscape 3.9.1软件（https://cytoscape.org/）; CB Dock平台（http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/index.php）; 微生信在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）。

2 方法 2.1 供试品溶液的制备

益气祛风方配方比例为生黄芪∶穿山龙∶牛蒡子∶蝉蜕∶鬼箭羽∶水蛭=10∶10∶5∶4∶4∶1, 加10倍量水煎煮2次, 每次1 h, 合并滤液, 浓缩和真空干燥（70 ℃, 真空度为0.08 MPa）, 提取得率为19.66%。粉碎, 过60目筛, 即得中药干膏。取粉末约0.5 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇溶液25 mL, 超声提取30 min, 放冷, 摇匀, 离心, 取上清液过0.22 μm滤膜, 取续滤液, 即得。

2.2 色谱条件

色谱柱: AQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm, 1.7 μm）; 流动相: 0.1%甲酸水溶液（A）, 乙腈溶液（B）; 梯度洗脱条件: 0~3 min（5%~5%B）, 3~45 min（5%~75%B）, 45~45.1 min（75%~5%B）, 45.1~50 min（5%~5%B）; 流速: 0.3 mL/min; 进样量: 3 μL; 柱温: 35 ℃。

2.3 质谱条件

正离子检出模式: HESI-Ⅱ离子源, 离子源温度350 ℃, 喷雾电压3.5 KV, S-Lens RF电压60 V, 毛细管温度300 ℃, 鞘气和辅助气均为高纯氮气（纯度>99.99%）, 鞘气流速: 40 arb, 辅助气流速流速: 20 arb; 负离子检出模式: HESI-Ⅱ离子源, 离子源温度350 ℃, 电离源电压3.2 KV, S-Lens RF电压60 V, 鞘气和辅助气均为高纯氮气（纯度>99.99%）, 鞘气流速: 35 arb, 辅助气流速流速: 10 arb。

扫描模式: 一级全扫描（Full Scan, m/z 100-2 000）与数据依赖性二级质谱扫描（data-dependent acquisistion）ddMS2;分辨率: 70 000（Full Scan）, 17 500（MS/MS）; 碰撞模式: 高能量碰撞解离（HCD）, 碰撞能量: NEC30, Stepped NEC50%。

2.4 化学成分的鉴定及其活性成分的筛选

通过Xcalibur软件进行数据的采集, 经与自建数据库检索进行数据解析。中国知网、万方、维普网及PubMed数据库检索并构建益气祛风方原药材相关化学成分数据库, 在Compound Discoverer 3.1软件检索在线及构建的化合物数据库, 并比对精确相对分子质量, 根据参考文献提供的保留时间及二级碎片离子信息进行确证。

2.5 药物活性成分靶点筛选、DN疾病靶点预测

将上一步药物质谱分析得到的成分逐一输入PubChem数据库, 获得分子结构并以*.sdf格式保存。将*.sdf格式文件上传至Swiss ADME平台, 使用TCMSP平台进行补充, 获得吸收度及类药性等相关参数, 筛选吸收度高、类药性好的成分。将筛选后成分的*.sdf格式文件导入Swiss Target Prediction平台, 设置属性为“Homo sapiens”, 收集预测到的所有靶点, 同时在TCMIP、HERB等数据库检索成分名称, 补充相关靶点, 整合后得到药物活性成分靶点库。以“Diabetic Nephropathies”为关键词在Gene Card数据库及OMIM数据库中检索相关疾病靶点, 将搜索结果整合去重获得DN疾病靶点预测库。通过R语言将药物活性脚本和疾病靶点取交集并绘制韦恩图, 得到药物-疾病交集靶点。

2.6 核心靶点筛选及蛋白相互作用网络构建

将药物-疾病交集靶点导入String平台, 设置物种为“Homo sapiens”, 最小相互作用阈值为“Highest confidence（0.90）”, 构建蛋白相互作用网络（PPI）。将该网络导入Cytoscape3.9.1软件, 使用“Analyze Network”进行网络拓扑学分析, 利用连接度（degree）、介数中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）3个拓扑参数进行筛选, 获得核心基因靶点。

2.7 基因本体（GO）功能分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

利用Metascape数据库对核心靶点基因进行GO功能分析和KEGG通路富集分析, 物种为“Homo sapiens”, 设定P＜0.01, 分析益气祛风方的治疗DN涉及的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组成（CC）和通路, 根据富集基因数目由多到少进行降序排列, 利用微生信平台对位居前列的生物学过程和通路绘制GO功能富集分析柱状图和KEGG通路富集分析气泡图。

2.8 益气祛风方主要成分筛选与关键靶点分子对接

2.6中形成PPI靶点对应的成分即为主要成分。从RCSB PDB数据库或AlphaFold数据库获得核心靶点的晶体结构, 与2.5中获得的活性成分的sdf式, 通过CB Dock进行分子对接[10], 分析结合能。结合能体现两者能否形成稳定对接结构, 故如结合能＜-5 kcal/mol则说明结合构象相对稳定。

2.9 动物实验验证

db/db小鼠普通饲料无干预适应性饲养2周, 自由摄食饮水。2周后, 禁食不禁水6 h后测定小鼠空腹尾尖血糖, ≥16.7 mmol/L为造模成功, 随机分为模型组、益气祛风方组, db/m小鼠为空白组, 每组6只。db/db小鼠给药剂量换算后灌胃益气祛风方干膏粉3.04 g/（kg· d）, db/m小鼠灌胃等量生理盐水, 共干预8周。提取肾组织总蛋白进行Western Blotting, 加入冰盒控制电转温度, 将转好的PVDF膜于慢摇床上用5%的脱脂牛奶封闭1 h。稀释一抗IL-1β（1∶300）、CCL5（1∶300）、NF-κB（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、β-actin（1∶3 000）, 4 ℃封闭过夜。TBST清洗5次, 每次5 min, 室温孵育二抗90 min, TBST清洗5次。ECL显色液激发PVDF膜1 min, 进行曝光、显影、拍照, 使用ImageJ分析灰度值以反映不同组别间蛋白表达量。使用GraphPad Prism 9进行统计分析, P＜0.05为差异性判断标准, 以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果 3.1 益气祛风方活性成分分析及筛选

从益气祛风方中共鉴定出115个化学成分, 总离子流图见图 1, 鉴定信息见开放科学计划（OSID）二维码。通过PubChem数据库获得所有成分的CID、Canonical SMILES及分子结构文件（*.sdf）, 导入Swiss ADME平台, 在结果中筛选GI absorption为“High”（即消化道吸收度高）, 用于筛选口服生物利用度较好的活性化合物; 筛选Druglikeness预测中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge5项有2项或2项以上为“Yes”的化合物, 选择具有较好类药性的化合物, 共得到满足条件的活性成分66个。在TCMSP中检索GI absorption为“Low”（即消化道吸收度低）的成分, 补充牛蒡子苷（Arctiin, OB 34.45%, DL 0.84）及香蜂草苷（Didymin, OB 38.55%, DL 0.24）。根据文献补充黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ[11]、山奈苷[12]、柳穿鱼黄素[13]、京尼平苷[14]、纤细薯蓣皂苷[15]、粗糠柴苦素[16]及大豆皂苷Ⅰ[17]。这些成分虽然消化道吸收度低, 但有文献报道其通过口服途径取效, 故纳入后续分析。共筛选得到76个成分。

图 1 益气祛风方中UHPLC- Q-Exactive Orbitrap MS鉴定的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion chromatogram of Yiqi Qufeng Formula by UHPLC- Q-Exactive Orbitrap MS
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3.2 益气祛风方治疗DN的潜在作用靶点预测

将上一步筛选得到的76个成分SDF格式文件导入Swiss Target Prediction平台, 同时使用TCMIP、HERB平台检索化合物名称补充靶点, 整合预测结果, 共预测到作用靶点5 064个。根据预测所得靶点的“Probability”值, 取中位数（0.111 5）以上的靶点共2 688个, 去重后共得到作用靶点615个。

通过Gene Cards数据库检索得到疾病相关靶点, 结合OMIM数据库补充, 合并后删除重复值, 得到相关靶点4 911个。筛选“Relevance score”为中位数（3.549 8）以上的靶点, 最终得到DN相关靶点共2 025个。将活性成分作用靶点与DN相关靶点取交集, 获得益气祛风方治疗DN的潜在靶点266个, 并使用R语言绘制韦恩图, 见图 2。

图 2 益气祛风方治疗DN的潜在作用靶点 Fig. 2 Potential targets of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN
图选项
3.3 益气祛风方治疗DN的主要成分及核心靶点筛选

将266个潜在作用靶点输入STRING数据库, 设置最小相互作用阈值为“Highest confidence（0.90）”并隐藏游离节点后, 保留227个靶点, 1 133条连线, average node degree=8.52, PPI enrichment P-value＜1.0e-16, 得到潜在作用靶点PPI网络图, 见图 3。这227个靶点对应的活性成分即为主要成分, 部分成分信息见表 2。将该蛋白互作网络导入Cytoscape3.9.1, 选择介数中心性、接近中心性、连接度均大于中位数的靶点, 即介数中心性≥0.010 525 717、接近中心性≥0.412 322 275、连接度≥6, 筛选得到78个靶点, 即为益气祛风方治疗DN的核心靶点。3个拓扑学参数中, 介数中心性表示点在其他点之间的中介调节效应, 数值越大表明网络节点间的联系经过该点次数越多; 接近中心性表示点在复杂网络中的价值, 数值越大表明点越在中心位置; 连接度则强调节点单独的价值[18]。以介数中心性为主, 接近中心性、连接度为次进行排序, 见表 3、图 4。

图 3 益气祛风方治疗DN潜在作用靶点的PPI网络图 Fig. 3 PPI network of the potential targets of YQQF in the treatment of DN
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表 2 益气祛风方治疗DN的部分主要成分 Tab. 2 Parts of the active components of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN
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表 3 益气祛风方排名前20的核心靶点拓扑信息 Tab. 3 Topological information of the top 20 core targets of Yiqi Qufeng Formula
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图 4 益气祛风方治疗DN核心靶点互作图 Fig. 4 Interaction diagram of the core targets of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN
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圆形越大BC越大, 颜色越深CC越大, 连线越深CombineScore越高, 核心靶点以外的节点已隐藏。

3.4 核心靶点的GO功能与KEGG通路富集分析

将78个核心靶点导入Metascape数据库进行富集分析。GO富集分析共得到223个BP相关条目, 包括response to hormone（对激素的反应）、protein phosphorylation（蛋白质的磷酸化）、transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway（跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路）、positive regulation of cell migration（细胞迁移的正向调节）与regulation of defense response（防御反应的调节）等。74个CC相关条目, 包括membrane raft（膜筏）、receptor complex（受体复合物）、perinuclear region of cytoplasm（细胞质的核周围区域）等。84个MF相关条目, 包括protein kinase activity（蛋白激酶活性）、phosphatase binding（磷酸酶结合）与protein tyrosine kinase activity（蛋白酪氨酸激酶活性）等, 图 5为依据P值排序后的前15个BP条目与前7个CC、MF条目。KEGG信号通路富集分析共获得176条结果, 结合文献筛选前20条与DN相关的通路并进行分类注释, 包括PI3K/Akt信号传导通路/脂质及动脉硬化、糖尿病并发症中晚期糖基化终产物及受体信号传导通路（AGE/RAGE）、趋化因子（Chemokine）信号传导通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号传导通路等, 见图 6、7。

图 5 益气祛风方治疗DN核心靶点的GO富集分析图 Fig. 5 GO enrichment analysis of the key targets of Yiqi Qufeng Formula for treatment of DN
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图 6 益气祛风方治疗DN核心靶点的KEGG富集通路图 Fig. 6 KEGG enrichment analysis of key targets of Yiqi Qufeng Formula for treatment of DN
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图 7 KEGG通路注释图 Fig. 7 KEGG pathway annotation map
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3.5 益气祛风方“主要成分-核心靶点-信号通路”网络的构建

将上述信号通路、相关靶点及活性成分关系导入Cytoscape3.9.1, 得到“核心成分-核心靶点-信号通路”网络图, 见图 8。

注：浅绿色圆形代表活性成分，橙色三角形代表信号通路，蓝色方形代表作用靶点，圆形与三角形的大小与degree值正相关，图形越大，degree值越大。 图 8 益气祛风方治疗DN的“主要成分-核心靶点-信号通路”网络 Fig. 8 Network for active component-key target-signaling pathway of Yiqi Qufeng Formula for treatment of DN
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3.6 主要活性成分与关键靶点的分子对接

用于分子对接的受体根据拓扑参数选择核心靶点中的HSP90AA1（G3V2J8）、PIK3R1（P27986）、EP300（Q09472）、PRKCZ（Q05513）、HRAS（6Q21）、MAPK3（P27361）、IL6（P05231）、ESR1（P03372）、MAPK1（P28482）、NR3C1（P04150）和STAT3（P40763）, 配体即活性成分根据筛选结果及文献选择生松素、荠苧黄酮、槲皮素、N-乙酰多巴胺二聚体-1、N-乙酰多巴胺二聚体-2、京尼平苷、牛蒡子苷、黄芪甲苷及纤细薯蓣皂苷。分子对接结果显示, 所选主要活性成分与靶点的结合能均大于-5 kcal/mol, 见图 9。当配体和受体的构象稳定时, 能量越低, 结合的可能性越大, 结合能＜0表示可以自发结合, 该值越低则结合强度越大。活性与蛋白靶点有效的结合是药物发挥作用的前提, 分子对接结果表明大部分活性成分与核心靶点具有良好的结合活性。

注：“N-1”为N-乙酰多巴胺二聚体-1，“N-2”为N-乙酰多巴胺二聚体-2。单位为kacl/mol。 图 9 益气祛风方治疗DN主要活性成分与关键靶点的分子对接结合能热图 Fig. 9 Heat map for binding energy between main active components and key targets of Yiqi Qufeng Formula
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3.7 动物实验验证

对部分关键靶点如IL-6、NF-κB及关键通路PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路的下游效应炎性因子进行验证。Western blotting结果显示, 模型组小鼠肾脏pNF-κB、IL-6、IL-1β、CCL5表达量均显著增加（P＜0.05, P＜0.001）, 与模型组相比, 益气祛风方组pNF-κB、IL-6、IL-1β表达量显著下降（P＜0.05）, CCL5表达量趋势性下降, 见图 12、13。

4 讨论

DN发病机制复杂, 具体的发病机制尚未十分明确, 根据目前研究进展, 认为DN的发生发展与血流动力学改变、糖脂代谢紊乱、免疫炎症反应、细胞自噬、氧化应激及micro RNAs等多因素相关[19]。本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术, 结合网络药理学多平台、多数据库分析, 探讨益气祛风方治疗DN相关的活性成分、靶点及机制。

本研究鉴定出益气祛风方中115个活性成分, 筛选出55个主要成分和78个核心靶点, 主要成分中包括生松素、荠苧黄酮、槲皮素、N-乙酰多巴胺二聚体-1、N-乙酰多巴胺二聚体-2、京尼平苷、牛蒡子苷、黄芪甲苷及纤细薯蓣皂苷等。生松素来源于黄芪, 为天然黄酮类化合物, 具有广泛的抗炎、抗菌、抗癌及神经保护作用, 可通过抑制AGE-RAGE通路进一步抑制NF-κB活化, 阻断Caspase 3/7和9的活化[20], 在DN动物模型中可改善肾功能、尿蛋白及血脂谱, 缓解氧化应激, 减轻基底膜增厚[21]。荠苧黄酮来源于鬼箭羽, 可清除自由基、抑制炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的释放, 降低氧化应激和炎性反应[22]。槲皮素是一种抗炎及抗纤维化的化合物, 来源于黄芪、鬼箭羽, 可以通过减少氧化应激、减轻炎症、消除自由基和抑制肾小球乳头状细胞增生（DN的早期病理变化之一）来延缓DN的进展[23]。它调控PI3k/Akt和HIF1-α信号通路, 以缓解慢性肾脏疾病或肾脏炎症[24-25]; 影响参与胰岛素抵抗和2型糖尿病发病机制的许多因素和信号通路, 包括TNF-α、NF-κB、AMPK、AKT和Nrf2[26]。N-乙酰多巴胺二聚体-1与N-乙酰多巴胺二聚体-2来源于蝉蜕, 两者均可有效抑制活性氧类（ROS）和一氧化氮（NO）产生, 抑制NF-κB活性以及促炎分子如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-6、TNF-α和环氧合酶（COX）-2的表达[27], 还可改善脂质代谢[28]。京尼平苷来源于水蛭, 可有效改善DN小鼠的肾功能, 减轻基底膜增厚和炎性细胞浸润, 降低炎性因子水平, 可通过调控APMK/SIRT1/NF-κB发挥作用[14]。牛蒡子苷是牛蒡子的主要药效成分之一, 在DN动物模型中可显著降低24 h尿白蛋白水平, 防止肾小球硬化, 并通过上调nephrin和podocin的表达, 下调乙酰肝素酶（HPSE）水平, 有效地恢复肾小球滤过屏障损伤[29]; 还可通过激活Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶（ROCK1）和基因功能磷脂酶和张力蛋白同源物（PTEN）、抑制PI3K/Akt通路来下调血管内皮生长因子（VEGF）, 从而抑制高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞的增殖[30]。黄芪甲苷是黄芪皂苷中的主要成分, 可降低DN大鼠尿蛋白水平, 减轻足细胞及肾小管损伤, 减缓DN肾纤维化进展, 可通过调控TGF-β1/PI3K/Akt信号通路、Toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号通路、NLRP3/Caspase-1信号通路等诸多途径发挥作用[31]。纤细薯蓣皂苷是来源于穿山龙甾体皂苷类成分, 目前研究主要关注其抗肿瘤作用, 其调控自噬与凋亡主要通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路和信号转导及转蛋激活蛋白3（STAT3）、JAK2等靶点[32], 与本研究中富集分析得到的核心通路、靶点一致, 分子对接结果也可提供证据。

PPI网络分析提示本方通过以HSP90AA1、EP300基因编码E1A结合蛋白P300（EP300）、PIK3R1、MAPK3、MAPK1、HRAS、IL-6、PRKCZ、雌激素受体1（ESR1）、核受体亚家族3C组成员1（NR3C1）及STAT3等为核心的一系列靶点起作用。HSP90AA1基因编码热休克蛋白90α, 是热休克蛋白C（HSP90）的一种应激诱导型异构体, 可在肾小球足细胞中表达。抑制HSP90可以改善DM小鼠的胰岛素敏感性和高脂饮食引起的肾衰竭[33-34]; 进一步可抑制NF-κB和STAT信号通路调节的细胞过程来改善DM相关的肾损伤和动脉硬化[35]。EP300是赖氨酸乙酰转移酶和基因转录的主要调节因子, 是细胞的增殖、凋亡和分化等过程中的关键蛋白。EP300基因多态性与DN的发生发展相关, 机制可能为增加缺氧诱导因子2α（HIF2α）的表达以促进肾小管上皮细胞的纤维化[36]。PIK3R1基因编码磷脂酰肌醇3-激酶p85α调节亚基1蛋白（PIK3R1）, 它与p110催化亚基紧密连接, 共同构成PI3K蛋白, 是AKT信号通路中的关键蛋白, 调节细胞存活、生长、分化、葡萄糖运输和利用。PIK3R1在胰岛素信号传导中起直接作用, 突变可导致严重的胰岛素抵抗[37]。MAPK3与MAPK1同源, 两者分别编码丝裂原活化蛋白激酶3和1（或称胞外信号调节激酶2和1, MAPK3/ERK2、MAPK1/ERK1）, 作为多种生化信号的整合点参与多种细胞过程, 如增殖、分化、转录调节和发育。DN动物模型中, ERK1/2的异常激活可抑制足细胞及肾小管上皮细胞自噬[38], 或促使下游JNK和P38激活, 加剧炎症反应, 导致肾纤维化[39]。PRKCZ编码蛋白激酶C的ζ型, 在PI3K和MAPK级联中起作用, 参与有丝分裂信号传导、细胞增殖、细胞极性、炎症反应等生理过程。胰岛素信号通路中可作为PI3K的下游效应子, 并有助于激活葡萄糖转运蛋白SLC2A4/GLUT4的易位和葡萄糖在脂肪细胞中的转运。该基因也与2DM易感性相关[40]。

通路富集分析结果包含PI3K/Akt信号传导通路、脂质及动脉硬化、AGE/RAGE信号传导通路等。PI3K/AKT信号通路具有促进细胞增殖与抑制细胞凋亡的作用, 是DN免疫炎症机制中的一条重要信号通路, 与系膜基质增生、基底膜增厚、足细胞损伤以及肾小管上皮细胞转分化等具有密切的联系[41]。AGEs是高糖环境下的代谢产物, 一方面直接损伤肾脏细胞和组织, 另一方面与RAGE结合形成AGE/RAGE信号通路, 可激活下游包括PI3K/AKT、MAPK/ERK和NF-κB等在内的多个信号通路, 共同参与DN的氧化应激、炎症和足细胞凋亡过程[41-42]。DN的发展和进展与血脂异常密切相关[43], 由于DM患者胰岛素功能失调, 血脂异常在DM患者中很常见。由于脂质代谢过程中动脉粥样硬化脂质化合物的增加, 加剧肾脏微血管病变[44-45], 成为DN的发生发展因素之一。本课题组前期研究已证明益气祛风通络法在动物模型中可以起到降低蛋白尿、减轻肾间质纤维化以及延缓肾小球硬化的作用, 延缓动脉硬化效果明显; 经药物干预后, 肾组织中p-PI3K、p-AKT水平显著低于模型组, 且通路抑制因子PTEN的表达明显高于模型组, 故其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路进而下调NF-κB、单柱细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎症因子的表达水平有关[8]。本研究通过对益气祛风方与DN之间PPI的构建与益气祛风通络方化合物-蛋白分子对接的研究, 初步分析了益气祛风方中黄芪、牛蒡子、穿山龙、鬼箭羽、蝉蜕、水蛭的有效活性成分, 在益气祛风方治疗DN的机制方面提供了理论依据。

注：A. Astragaloside A-EP300；B. N-2-PRKCZ；C. Quercetin-IL-6；D. Gracillin-STAT3。 图 10 部分分子对接图 Fig. 10 Partial molecular docking diagram
图选项
注：Con.空白组，DM.模型组；YQQF.益气袪风方组。*P<0.05，*** P<0.001。 图 11 pNF-κB、IL-6、IL-1β、CCL5蛋白表达（n=4） Fig. 11 pNF-κB, IL-6, IL-1β, CCL5 protein expression (n=4)
图选项

综上所述, 本研究通过网络药理学的方法, 预测出益气祛风方中黄芪、牛蒡子、穿山龙、鬼箭羽、蝉蜕、水蛭治疗DN的潜在作用靶点和通路, 并通过分子对接技术与文献研究, 得到相应的数据进行补充分析, 体现了中药多成分、多靶点协同作用于疾病的特点, 为进一步探讨益气祛风方和中医“从风论治”法的作用机制提供新思路, 也为DN的治疗作用机制研究提供了新的参考和方向。

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Mechanism of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of diabetic nephropathy based on UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS and network pharmacology
ZHU Liwei1 , WANG Chunguo2 , FU Xiaozhe1 , HUANG Weijun1 , LI Xiaoran1 , ZHAO Jinxi1     
1. Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China;
2. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
Abstract: [Objective] To analyze the material basis and mechanism of Yiqi Qufeng Formula(YQQF) in the prevention and treatment of diabetic nephropathy (DN) by means of ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole electrostatic field orbitrap mass spectrometry(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS) combined with network pharmacology and molecular docking technology. [Methods] The main chemical components of YQQF were identified by UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS, and the "main component-core target-signal pathway" network was constructed by network pharmacology. GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were conducted, and molecular docking between the main active components and core targets was conducted. [Results] A total of 115 chemical components were identified from YQQF and 40 core targets were obtained, mainly involving PI3K-Akt signaling pathway, lipid-arteriosclerosis, AGE-RAGE signaling pathway, chemokine signaling pathway and HIF-1 signaling pathway. Molecular docking results showed that pinocembrin, mosloflavone, quercetin, N-acetyldopamine dimer-1, N-acetyldopamine dimer-2 and other components had good binding activity with some core targets. [Conclusion] This study preliminarily identified the potential effective components of YQQF, providing ideas for further research on the "wind-based treatment" method and the mechanism of YQQF.
Key words: wind-based treatment    diabetic nephropathy    network pharmacology    UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS    molecular docking