缺血性脑血管疾病严重危害着人类的生命健康，及时恢复血流以实现再灌注是目前最常用的治疗策略，但该策略在挽救患者生命的同时又会产生新损伤，即脑缺血再灌注损伤（CIRI）^[1]。CIRI是一种复杂的级联反应性病理生理过程，涉及多种发病机制。研究表明，CIRI可损伤神经元轴突及突触结构，进一步导致海马、大脑皮层等部位神经元死亡^[2-3]。因此，神经元突触重塑在减轻CIRI以及神经组织修复方面发挥重要作用。

具有多环节、多靶点、多途径等作用特点的中药在防治CIRI方面具有独特的作用^[4]。中药红花（Carthamus tinctorius L.）具有通络活血、祛瘀止痛的功效，常用于心脑血管疾病（如高血压病、冠心病、脑血栓）的辅助治疗，其主要活性成分为水溶性成分红花黄色素（SY），其中羟基红花黄色素A（HSYA）为红花黄色素中含量较高的成分^[5]。药理研究表明，HSYA能抗兴奋性毒性、抗氧化应激、抗凋亡、抗炎、保护血脑屏障和调节自噬，还能促进突触可塑性，从而发挥抗CIRI的作用^[6-7]。Yu等^[8]研究发现HSYA可增强大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠基底兴奋性突触传递，并诱导海马长时程增强（LTP），增加脑源性神经生长因子（BDNF）和GluN2B的表达，增强突触可塑性，但是对CIRI后神经元突触重塑的作用机制尚未研究。

本研究体外原代培养皮层神经元，建立缺氧/复氧（H/R）损伤模型模拟CIRI，通过考察HSYA对H/R损伤后神经元活力及乳酸脱氢酶（LDH）的影响，明确其神经保护作用；并考察HSYA对H/R损伤的神经元中BDNF、生长相关蛋白43（GAP-43）以及NogoA mRNA和蛋白表达的影响，初步探讨HSYA抗H/R所致神经元损伤的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

Wistar大鼠16 d孕鼠，清洁级，由天津中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物与主要试剂

HSYA（天津一方科技有限责任公司，中国），DMEM/F12培养基、B-27（GIBCO公司，美国），胰酶1∶250（Ameresco公司，美国），胎牛血清（FBS，HYCLONE公司，美国），LDH检测试剂盒（北京中生生物工程高技术公司，中国），四甲基偶氮唑盐（MTT），二甲基亚砜（DMSO）、多聚赖氨酸（SIGMA公司，美国），青霉素、链霉素（市售分析纯）、Trizol（上海生工生物技术有限公司）、逆转录试剂盒、聚合酶链反应（PCR）试剂盒（宝生物工程有限公司）；BDNF、GAP-43及Nogo-A酶联免疫试剂盒（R&D公司），丙三醇、氯仿、无水乙醇（分析纯，天津市化学试剂厂），BDNF、GAP-43及Nogo-A mRNA的上、下游引物（上海生工生物技术有限公司）。

1.3 主要仪器

CO₂恒温培养箱（THERMO，FORMA3111型，美国），倒置相差显微镜（LEIClA DMIL，德国），三气培养箱（MODEL 3131，THERMO，美国），酶标仪（Multiskan Ascent，THERMO LABSYSTEMS，美国），微量多功能读板机（NanoQuant，infinite M200，瑞士），ABI^®7300型实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，美国）。

1.4 方法 1.4.1 神经元原代培养

参照本课题组前期实验方法^[9]，取怀孕16 d的Wistar大鼠，颈椎脱臼处死，用75%医用酒精浸泡3~5 min，于无菌条件下取出胚胎大脑皮层，剔除脑膜及大血管。将皮质剪碎约1 mm³大小，加入适量0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化5 min。立即加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液终止消化，并将组织完全吹散。经75 μm筛网过滤，收集滤液；800 r/min离心10 min（本研究所用离心机半径均为13 cm），弃上清，收集沉淀。用含体积分数10% FBS的DMEM/F12培养液将细胞重悬。调整细胞密度至1×10⁶/mL，接种于预先涂有0.01%多聚赖氨酸的培养板中，置于培养箱培养4 h后，置换为无血清DMEM/F12培养液（含体积分数2% B-27，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素）。以后，每2 d半量换液1次，细胞生长至第7天时可用于实验。

1.4.2 实验分组及给药

取接种于6孔或者96孔细胞培养板中的神经元，每组设平行6孔，随机分为正常对照组、H/R组、羟基红花黄色素A低（5 μg/mL）、中（20 μg/mL）、高（80 μg/mL）剂量组，具体处理方法如下。正常对照组：置换无血清培养液继续培养48 h，不做H/R处理；H/R组：置换无血清培养液，将培养板放入体积分数分别为0.94 N₂、0.05 CO₂、0.01 O₂的三气培养箱中缺氧孵育24 h，再于体积分数分别为0.95空气、0.05 CO₂条件下复氧孵育24 h；HSYA低、中、高剂量组：分别置换为含5、20、80 μg/mL HSYA的无血清培养液，H/R处理同H/R组。

1.4.3 指标检测 1.4.3.1 噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力

取接种于96孔板的神经元，收集培养上清液（用于LDH检测），将MTT液按0.5 mg/mL的浓度加入100 μL/孔，继续孵育4 h后，倒置显微镜下可见活细胞处有大量紫蓝色针状结晶，弃上清，加DMSO 100 μL/孔溶解后，酶标仪上读取OD值，波长为570 nm。

1.4.3.2 LDH试剂盒检测细胞上清液中LDH活性

取细胞上清液，按照试剂盒说明书方法操作，以全自动生化分析仪测定LDH活性。

1.4.3.3 RT-PCR检测BDNF、GAP-43及Nogo-A mRNA表达水平

取接种于6孔板的神经元，弃培养液，用冷磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗2次，每孔加入1 mL裂解液TRIzol，反复吹打，室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加0.2 mL氯仿，剧烈振荡，室温放置15~30 min后，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，将水相转移到新的无RNase的离心管中，缓慢加入1倍体积-20 ℃保存的丙三醇，混匀，置-20 ℃ 2 h以上，充分沉淀RNA。4 ℃ 10 000×g离心10 min，弃上清。沉淀加入75%乙醇1 mL，重新悬浮，4℃ 8 000×g离心10 min，弃上清。在超净台内室温挥发5 min，加入适量无RNnase水轻轻吹打沉淀，使之溶解，用紫外分光光度法检测RNA样品的浓度及纯度。反转录，应用ABI^®7300实时定量PCR仪分析软件进行分析，获得每个样品每次反应的CT值，计算得到其△CT，进行数据统计^[10]。

1.4.3.4 ELISA检测BDNF、GAP-43及Nogo-A蛋白表达水平

收集各组上清液，1 000 r/min离心10 min。将50 μL标准品、50 μL样品加入相应反应孔，立即加入50 μL的生物素标记的抗体，混匀，37 ℃温育1 h，洗板3次，每孔加入60 μL的亲和链霉素-HRP，37 ℃温育30 min，洗板3次，每孔加入底物A、B各50 μL，混匀30 s，封板，37 ℃避光温育10 min，每孔加入终止液50 μL，立即于450 nm波长处检测，根据标准曲线方程计算浓度。

1.5 统计学方法

运用SPSS 20.0软件包进行数据处理，所有数据采用均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 HSYA对缺氧/复氧损伤神经元活力的影响

与正常对照组比较，H/R组神经元活力显著降低（P＜0.01）；与H/R组比较，HSYA低、中、高剂量组神经元活力均显著增强（P＜0.01）。见图 1。

2.2 HSYA对缺氧/复氧损伤神经元LDH释放的影响

与正常对照组比较，H/R组神经元LDH释放明显增加（P＜0.05）。与H/R组比较，HSYA低、中、高剂量组神经元LDH释放均显著减少（P＜0.01）。见图 2。

2.3 HSYA对H/R损伤神经元中BDNF、GAP-43及Nogo-A mRNA表达的影响

与正常对照组比较，H/R组BDNF及GAP-43 mRNA表达均显著降低（P＜0.05），Nogo-A mRNA表达显著增加（P＜0.01）；与H/R组比较，HSYA低、中、高剂量均可显著促进BDNF mRNA表达（P＜0.05或P＜0.01），且抑制Nogo-A mRNA表达（P＜0.05或P＜0.01）；HSYA中、高剂量可显著促进GAP-43 mRNA表达（P＜0.05或P＜0.01）。见图 3、4、5。

2.4 HYSA对H/R损伤CNC的BDNF、GAP-43及Nogo-A蛋白表达水平的影响

与正常对照组比较，H/R组BDNF、GAP-43蛋白表达均显著降低（P＜0.05），NogoA蛋白表达水平显著提高（P＜0.01）；与H/R组比较，HSYA低、中、高剂量均可显著降低BDNF蛋白表达水平（P＜0.05），且抑制Nogo-A蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）；HSYA中、高剂量可显著促进GAP-43 mRNA表达（P＜0.05）。见图 6、7、8。

3 讨论

CIRI最核心的问题是神经元损害引起的神经功能障碍，因此，保护和恢复受损神经元的功能成为治疗CIRI最重要的任务^[11]。近年来，诸多学者认为其治疗靶点不应仅仅局限于抵抗损伤的因素，而更应该着眼于内源性的神经保护机制和长期的恢复过程^[12]。

神经营养因子可诱导、调节和控制神经元的生存、生长、迁移以及与其他细胞建立功能性联系，并在神经再生过程中促进轴突的再生长。神经营养因子（NTFs）是一类对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用的蛋白质，主要分为：1）神经营养素（NT）家族，包括神经生长因子（NGF）、BDNF、神经营养因子-3（NT-3）、神经营养因子-4/5（NT-4/5）等。2）胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）。3）睫状神经营养因子（CNTF）。这些蛋白质已经成为治疗神经损伤等疾病的潜在药物标靶。其中BDNF是体内含量最多的神经营养因子。BDNF是从猪脑脊液中发现的一种具有神经营养作用的碱性蛋白质，BDNF及其受体在神经系统广泛表达，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。它通过与酪氨酸激酶受体B（TrkB）的结合而发挥作用，对神经元的生存、分化、生长和神经元正常生理功能具有维持和促进作用，而且还有增加突触可塑性及神经再生等作用^[13]。本研究结果显示，HSYA可有效抑制H/R引起的LDH释放，明显增加神经元细胞活力，表明HSYA能有效减轻H/R引起的神经元损伤。为了探究其作用机制，本研究进一步考察了HSYA对神经元表达及分泌BDNF的影响，结果表明HSYA可有效促进神经元释放BDNF。

此外，BDNF还可以促进突触成熟，增加突触可塑性^[14-15]。因此，本研究进一步考察HSYA是否可以通过促进BDNF表达而增加神经元突触可塑性。GAP-43是存在于神经元轴突生长锥中的一种特异性胞膜磷酸蛋白，广泛分布于大脑、小脑、脊髓、背根节以及自主神经系统的神经元内。在发育中的神经元内，沿整个轴突表达，在生长锥表达尤其丰富；而在成熟神经系统，主要分布于某些特定区域的神经终末中，在促进神经细胞生长、轴突再生和突触重构等方面发挥重要作用，已成为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子探针^[16-17]。Nogo-A是一种氨基酸的膜蛋白，是有效的轴突生长抑制因子，不仅表达于少突胶质细胞，还广泛表达于神经元，是反映神经损伤后是否可再生的指标之一^[18-19]。在生理状态下，Nogo-A对生长较迟的神经纤维起到约束的作用，神经纤维只能进入特定的区域层内。在成年哺乳动物中枢神经系统中，Nogo-A的主要作用是保持中枢神经系统微环境的稳定，防止不必要的出芽，有助于保持神经联系的特异性，防止形成不必要的、错误的投射，通过微管动力学调节参与轴突生长和树突塑形的进程。Nogo-A与其他生长抑制因子和神经生长促进因子呈平衡状态，当出现外界刺激后，其内部平衡被破坏，Nogo-A呈现抑制作用^[20-21]。以上两种蛋白均可一定程度地分泌到细胞外。本研究考察了HSYA对神经元内GAP-43和Nogo-A mRNA以及细胞上清液中二者蛋白含量的影响，结果显示，HSYA可促进GAP-43 mRNA及蛋白表达，同时抑制Nogo-A mRNA及蛋白表达，表明HSYA能有效增加神经元突触可塑性。

本研究初步表明HSYA抗H/R损伤神经元的作用机制可能是通过促进BDNF表达而改善神经元生存状态，并增加神经元突触可塑性。但该作用还有待从神经元突触微观形态学角度来进一步验证，其作用机制亦有待围绕BDNF/酪氨酸激酶B（TrkB）、Nogo-A/Nogo-A受体（NgR）等信号通路进行深入探讨。