天津中医药  2023, Vol. 40 Issue (12): 1581-1586 |
表1(Table 1)
化疗性肠黏膜炎（CIM）是癌症患者在接受化学药物治疗过程中，肠黏膜受到损伤，肠道屏障功能发生障碍所引起的主要的剂量限制性不良反应，主要临床表现为呕吐、腹泻、腹痛等[1]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是最常用的化疗药物之一，用于多种癌症的治疗，但是其导致CIM的几率高达80%，并且这些不良反应在治疗后会持续很长时间[2-4]。CIM也是癌症患者被迫停止化疗的一个重要原因，会导致患者的治疗效果不理想，严重影响患者的生活和生存质量[5]。目前临床上并无预防或治疗CIM的有效手段，因此，探索和开发防治CIM的药物和策略，对提高癌症患者的治疗效果及改善生存质量具有积极的意义。
越来越多的证据表明，中药在减轻化疗不良反应，尤其是胃肠道反应方面具有显著疗效[6]。生脉散首见于《医学启源》，是益气养阴的著名古方，由人参、麦冬、五味子组成，临床常用于多系统的气阴两虚证的治疗。现代药理研究表明，生脉散具有保护胃肠道的作用[7]。临床研究表明，生脉散加味与生脉注射液（成分同为红参、麦冬和五味子）都能够显著改善化疗导致的胃肠道反应，缓解骨髓抑制，提高化疗效果[8-10]。但生脉制剂对化疗所致结肠黏膜损伤的保护作用和机制尚不明确，本研究采用5-FU致小鼠CIM模型，探讨生脉胶囊对化疗导致的结肠黏膜损伤的保护作用，为进一步研究相关机制及临床应用提供实验基础。
1 材料 1.1 实验动物20只雄性Balb/c小鼠，6~8周龄，体质量20~22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2019-0008。饲养于天津中医药大学实验动物中心，实验前适应性饲养3 d，饲养环境：普通饲料，期间动物自由进食、饮水，温度22~26℃，湿度40%~70%，光照12 h。本研究经天津中医药大学动物伦理委员会审查批准，批号：TCM-LAEC2022131。
1.2 实验药物生脉胶囊药物成分为红参、麦冬、五味子，购买自正大青春宝药业有限公司（国药准字Z33021036），用蒸馏水重悬至所需浓度后进行灌胃。5-FU购买自上海生工生物工程股份有限公司，批号H202BA0024。用0.1 mol/L氢氧化钠和依地酸二钠溶至蒸馏水中配制成pH值为8.5~8.9的溶剂，将其与5-FU干粉配置所需浓度进行腹腔注射。
1.3 主要实验试剂与仪器二胺氧化酶（DAO）活性检测试剂盒（北京盒子生工科技有限公司，批号为1012201071）；免疫组化试剂盒、ki67抗体（均购于武汉三鹰有限公司，批号分别为30202104、27309-1-AP）；柠檬酸钠抗原修复液、增强型二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、糖原PAS染色试剂盒（均购于北京索莱宝科技有限公司，批号分别为20191128、20220614、20221104）；电子天平（上海天平仪器厂，JA1003）；石蜡切片机（Leica，RM2235）；电动倒置研究型生物显微镜（奥林巴斯公司，Ⅸ81）；离心机（Thermo Scientific，Sorvall Legend Micro 17R）。
2 方法 2.1 动物造模与分组20只小鼠适应性饲养3 d后随机分为3组，正常组（CTRL）5只、模型组（FU）7只、生脉组（FU+SM）8只。参考Zhang等[11]造模方法制备小鼠化疗性肠黏膜炎模型。除正常组外，其余两组小鼠分别于第1~3天和第6~8天腹腔注射5-FU溶液（25 mg/kg），每日1次。以体质量下降、腹泻和组织病理学损伤程度作为造模成功标准。
2.2 给药方法生脉组：以生脉胶囊悬液灌胃（350 mg/kg，参考说明书及《药理实验方法学》换算成小鼠给药剂量），每日1次，连续10 d；正常组和模型组灌胃等量蒸馏水，每日1次，连续10 d。
2.3 观察指标与方法 2.3.1 小鼠体质量和腹泻情况观察每日给药之前对各组小鼠体质量进行记录，每两日对小鼠腹泻情况进行一次评估，用干净的滤纸收集每组小鼠1 h内排出的粪便，以粪便周围有明显污迹定为稀便，每组稀便比例=稀便数/总粪便数。具体方法参考Yim等[12]改进的粪便收集方法，对每组小鼠稀便情况进行比较分析。
2.3.2 样本采集小鼠末次给药后禁食12 h，不限饮水，摘取小鼠眼球收集血液，以4 000 r/min离心10 min，离心半径为8.3 cm，分离血清，置于-80 ℃冰箱冻存备用。颈椎脱臼处死小鼠，剖腹收集从盲肠到肛门处的结肠，观察形态并测量长度，取近盲肠端2 cm结肠，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗干净后放入4%多聚甲醛固定，24 h更换固定液1次，固定48 h。
2.3.3 结肠的组织病理学观察将4%多聚甲醛中固定的结肠进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡包埋块切片厚度为5 μm，进行苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察各组小鼠结肠的组织病理改变。
2.3.4 血清中二胺氧化酶（DAO）活性的测定血清中DAO的活性用DAO活性检测试剂盒进行测定，所有操作方法严格按照试剂盒说明书步骤进行。
2.3.5 免疫组织化学法检测结肠黏膜中ki67的表达取结肠石蜡切片，经烤片、脱蜡；3%过氧化氢去除内源性过氧化氢酶；柠檬酸钠溶液进行抗原修复；5%山羊血清封闭；加入ki67抗体（稀释比1∶1 000）4 ℃孵育过夜；次日复温，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育30 min；DAB显色；苏木精复染，脱水、透明、封片。光学显微镜下观察、拍照，棕色为阳性表达。采用Image-Pro Plus图像分析软件分析平均OD值。
2.3.6 PAS染色法检测结肠黏膜中杯状细胞的数量取结肠石蜡切片，脱蜡入蒸馏水，后续所有操作方法严格按照糖原PAS染色试剂盒说明书步骤进行，红色或紫红色为PAS反应阳性物质。光学显微镜下观察、拍照。
2.4 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析与作图，所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示。多组间采用单因素方差分析进行比较，组间多重比较采用LSD法，P＜0.05表示差异有统计学意义。
3 结果 3.1 生脉胶囊改善5-FU所致肠黏膜炎小鼠结肠缩短和腹泻情况与正常组小鼠比较，模型组小鼠体质量从第3天开始显著下降，到第10天一直呈持续下降的趋势；稀便比例显著升高。与模型组小鼠比较，生脉组小鼠体质量下降情况有改善的趋势，但无统计学意义（P＞0.05），稀便比例则显著降低（见图 1A、表 1）。与正常组小鼠比较，模型组小鼠结肠明显缩短（P＜0.05），而生脉胶囊能够显著改善结肠缩短，增加小鼠结肠长度（P＜0.05）（见图 1B、1C）。表明生脉胶囊对于5-FU所致肠黏膜炎小鼠结肠缩短、腹泻严重的情况有明显的改善作用。
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| 注：CTRL.正常组；FU.模型组；FU+SM.生脉组。A.各组小鼠体质量统计；B.各组小鼠结肠长度图；C.各组小鼠结肠长度统计（*P < 0.05）。 图 1 生脉胶囊对5-FU所致肠黏膜炎小鼠体质量和结肠长度的影响 Fig. 1 Effect of Shengmai capsule on body weight and colon length in mice with 5-FU induced intestinal mucositis |
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光镜下可见正常组小鼠结肠黏膜结构完整，组织排列整齐，杯状细胞丰富，无炎性细胞浸润；模型组小鼠结肠黏膜结构模糊，隐窝腺体缺损或消失，杯状细胞减少，炎性细胞浸润显著；而生脉组小鼠结肠黏膜结构较模型组显著改善，隐窝腺体结构明显修复，可见增多的杯状细胞，仍见明显的炎细胞浸润（见图 2A）。与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清中DAO活性显著升高（P＜0.01），而与模型组相比，生脉胶囊能够显著降低小鼠血清中的DAO活性（P＜0.01）（见图 2B）。表明生脉胶囊对5-FU所致肠黏膜炎小鼠的结肠黏膜结构和肠屏障损伤具有明显的改善作用。
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| 注：CTRL.正常组；FU.模型组；FU+SM.生脉组。A.各组小鼠结肠组织HE染色（×100，100 μm；×200，50 μm）；B.各组小鼠血清DAO活性（**P < 0.01）。 图 2 生脉胶囊对5-FU所致肠黏膜炎小鼠结肠病理形态及肠屏障损伤的影响 Fig. 2 Effect of Shengmai capsule on the pathological morphology and intestinal barrier damage of the colon in mice with 5-FU induced intestinal mucositis |
免疫组织化学染色结果显示，模型组小鼠结肠中的ki67阳性细胞数较正常组小鼠显著升高（P＜0.000 1），而与模型组小鼠比较，生脉组小鼠结肠中ki67阳性细胞数进一步增高（P＜0.000 1）（见图 3A、3B）。PAS染色结果显示，与正常组小鼠比较，模型组小鼠结肠黏膜上皮中的杯状细胞数量明显减少，而与模型组小鼠比较，生脉组小鼠结肠黏膜上皮中杯状细胞数量明显增多（见图 3C）。表明生脉胶囊能够促进5-FU所致小鼠结肠黏膜损伤后的肠上皮细胞的增殖及分化。
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| 注：CTRL.正常组；FU.模型组；FU+SM.生脉组。A.各组小鼠结肠组织ki67免疫组化染色（×100，100 μm；×200，50 μm）；B.各组小鼠结肠组织ki67免疫组化平均光密度值统计（****P < 0.000 1）；C.各组小鼠结肠组织PAS染色（×100，100 μm；×200，50 μm）。 图 3 生脉胶囊对5-FU所致肠黏膜炎小鼠结肠黏膜中的细胞增殖及分化的影响 Fig. 3 Effect of Shengmai capsule on cell proliferation and differentiation in the colon mucosa of mice with 5-FU induced intestinal mucositis |
化疗是临床治疗肿瘤的常用手段，但药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常组织和细胞造成损伤[11]。肠黏膜炎是化疗患者最常见的不良反应，其主要临床症状表现为厌食、恶心、呕吐、腹泻和腹痛，还可能表现出感染性休克和多器官功能障碍等更严重的症状[1]。中医认为，化疗药物在影响肿瘤细胞的同时也会使人体的正气损耗，气血不足，阴阳失调，引起五脏六腑的损伤，其主要病位在脾肾，早期的主要表现为胃肠道的损害，又因化疗药物属于阳邪，具有“热”的特性，伤津耗气，因此中医治疗化疗导致的肠黏膜炎多以益气生津为主[13-15]。本研究所采用的生脉胶囊是在传统名方“生脉散”基础上应用现代制剂技术制成的中成药口服胶囊，药物成分为红参、麦冬、五味子，红参作为主药，发挥补气、生津之效；麦冬作为辅药，养阴生津，配伍红参，共同发挥气阴双补之功效；五味子作为佐使药，具有敛肺止汗、益气生津的功效。三药合用能起到养阴生津，益气复脉之功效[7]。
作为最常用的化疗药物之一，5-FU也被用来诱导CIM小鼠模型，其特征为腹泻、体质量减轻、肠黏膜完整性和肠隐窝被破坏等，并且其严重程度与5-FU的剂量呈现正相关性[11, 16]。在本研究中，与正常组比较，5-FU诱导的CIM模型组小鼠体质量显著降低，腹泻比例也显著升高，结肠黏膜结构明显被破坏，表明成功构建CIM模型。有研究[8-10]显示，以生脉散为基础的生脉类方能够减少化疗带来的胃肠道反应，改善患者生活质量。一项临床数据分析[17]表明，中医在治疗与化疗性肠黏膜炎有着相同发病机制且同为化疗患者常见的不良反应化疗性口腔黏膜炎时，使用最多的药物就是麦冬等养阴生津之品。而五味子多糖也被证实能够改善化疗引起的肠道黏膜炎症状[18]。本研究结果还显示，生脉胶囊能够改善CIM小鼠的腹泻情况，增加结肠长度，减轻结肠的组织病理损伤，结合相关研究及数据分析，可以表明生脉胶囊对化疗性肠黏膜炎具有保护作用。
肠道黏膜是抵御外界环境最重要的屏障之一，CIM这类肠道炎症可破坏肠屏障结构，导致肠屏障功能受损[19-21]。DAO是存在于肠黏膜上皮细胞中的一种反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度的细胞内酶，它能够调节细胞内的离子平衡、影响传导通路、促进细胞修复，对肠黏膜具有保护作用[22]。正常机体血清中DAO活性很低，当肠黏膜受到损伤时，会导致血清中DAO活性增高，因此血清DAO活性是反映肠黏膜损伤程度的理想指标[22-24]。在5-FU诱导的模型组小鼠中可以观察到，结肠黏膜被破坏，血清中DAO活性显著增加，而经过生脉胶囊治疗的小鼠其结肠黏膜损伤得到改善，血清中的DAO活性显著降低，这表明生脉胶囊能够在一定程度上减轻5-FU导致的肠道屏障损伤。
5-FU等化疗药物引起的肠黏膜炎，损害胃肠道黏膜的过程可以概括为5个阶段，开始、初级损伤反应、信号放大、溃疡和愈合[25]。而最后1个阶段是通过上皮细胞的增殖和分化来实现肠屏障的重建和愈合[16, 26]，促进肠屏障的愈合也是治疗CIM这类肠道炎症的关键[20]。由上皮细胞分化的杯状细胞已经被证明对维持结肠黏液屏障功能至关重要，它的缺失也是结肠炎的标志[27]。表达在细胞核中的蛋白ki67是使用最广泛的增殖标志物之一，本研究发现，模型组小鼠结肠ki67表达高于正常组，表明5-FU导致的结肠黏膜损伤激活了肠道修复，而与模型组相比，生脉胶囊组进一步提高了ki67的表达，另外，与模型组比较，生脉胶囊可明显提高结肠组织中杯状细胞的数量，表明生脉胶囊可能进一步增强了5-FU导致的结肠黏膜损伤后的修复能力。
综上所述，生脉胶囊通过减轻结肠组织的损伤，促进结肠上皮细胞的增殖与分化来缓解小鼠肠道屏障损伤，加快损伤后肠黏膜的修复。证明生脉胶囊对5-FU导致的结肠黏膜损伤具有较好的保护作用，但其机制尚不明确，还有待进一步研究。
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