心力衰竭（HF）是ST抬高型急性心肌梗死（AMI）患者最常见并发症。据统计，AMI后1年内HF发病率超过45%，而AMI后HF（HF-AMI）患者5年生存率不足40%，HF-AMI是影响AMI患者中远期预后的重要因素^[1-2]。HF-AMI病理机制复杂，其中氧化应激和心肌组织纤维化在HF-AMI发生发展过程中扮演着重要角色，由核因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游蛋白血红素加氧酶1（HO-1）组成的信号通路对氧化应激具有重要调控作用。有文献报道通过干预Nrf2/HO-1信号通路可有效减轻HF-AMI大鼠心肌组织氧化应激和纤维化，改善心功能^[3]。

刺五加（又名五加参）为《中国药典（一部）》收录中药品种，以五加科植物刺五加的干燥根和根茎入药，性温、味辛，归脾、肾、心经，具有益气健脾、补肾安神等功效。刺五加注射液（CWJI）是以刺五加水醇提取物为有效成分制成的中成药，目前主要用于缺血性脑病以及冠心病、心绞痛的治疗。有研究报道CWJI可通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化应激对大鼠肾缺血再灌注损伤起到保护作用^[4]，并且CWJI对化疗药物等所致大鼠心肌损伤具有保护作用^[5-6]，但CWJI对HF-AMI大鼠的影响及相关机制尚未见文献报道。本研究通过复制HF-AMI大鼠模型，探讨CWJI对HF-AMI大鼠心肌组织的影响及相关机制，以期为HF-AMI临床治疗提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验动物

清洁级Wistar大鼠（雄性、7周龄、210~240 g）105只购自北京科宇动物养殖中心[许可证号：SCXK（京）2018-0010]。在（23±1）℃、相对湿度（55±10）%、光照12 h黑暗12 h的控制环境中饲养，进食饮水不限。本实验获得医院伦理委员会批准。实验动物相关操作遵循减少、替代、优化原则。

1.2 药物与试剂

CWJI（黑龙江乌苏里江制药有限公司，国药准字Z23023215，批号21A0917005）；卡托普利注射液（CPT，常州制药厂有限公司，国药准字H10970293，批号220113）；心肌肌钙蛋白T（cTnT）、血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒和苏木精-伊红（HE）、原位末端转移酶标记（TUNEL）、马松（Masson）染色试剂盒（北京索莱宝生物科技公司，货号SEKR-0047、SEKR-0049、G1120、T2190、G1340）；醛固酮（ALD）ELISA法试剂盒（泉州市睿信生物科技有限公司，货号RXJ302392R）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）检测试剂盒和RIPA裂解液、2，2’-联喹啉-4，4’-二甲酸二钠（BCA）法蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，货号S0109、S0056、S0131S、W063-1-1、A045-4-1）；活性氧（ROS）检测试剂盒、TRIzol总RNA提取试剂、一步法RT-PCR试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号E004-1-1、N065、N116）；Nrf2、HO-1、β-肌动蛋白（β-actin）抗体和免疫球蛋白G抗体（IgG二抗）、增强化学发光液（ECL）（北京博奥森生物技术公司，货号bs-1074R、bs-2075R、bs-0061R、bs-0295G、C05-07004）。

1.3 主要仪器

小动物呼吸机（DW-3000型，安徽正华生物仪器公司）；多普勒超声仪（770TM-120型，加拿大Visual Sonics公司）；生理信号采集系统（MP150型，美国BSI公司）；酶标仪（DTX880型，美国贝克曼公司）；紫外-可见分光光度计（ND2000C型，美国Thermo公司）；930F型荧光分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；石蜡切片机（RM2016型，上海徕卡仪器公司）；超薄切片机（EMUC7型，德国Leica公司）；透射电子显微镜（HT7700型，日本日立公司）；蛋白电泳转膜系统（PowerPac型，美国Bio-Rad公司）；QuantStudio 5型PCR仪（美国ABI公司）。

1.4 实验方法 1.4.1 HF-AMI大鼠模型制备与给药

适应性饲养1周后，随机取105只大鼠中的16只作为假手术（Sham）组，剩余89只通过结扎左冠状动脉前降支复制HF-AMI大鼠模型，结扎后心尖部位颜色变苍白、心电图ST段明显抬高或T波高耸则说明心肌梗死制备成功，2周后通过多普勒超声检测左室射血分数（LVEF），LVEF < 50%即可判定HF-AMI大鼠模型制备成功^[7]。共造模成功82只，随机取80只HF-AMI成模大鼠随机分为模型（Model）组、CPT组和CWJI低（CWJI-L）、中（CWJI-M）、高剂量（CWJI-H）组，每组16只。Sham组大鼠除了不结扎左冠状动脉前降支外，其余操作同Model组。CPT组腹腔注射给药10 mg/kg^[8]，CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组分别腹腔注射给药15、30、60 mg/kg（参照人临床应用剂量，根据人与大鼠剂量换算公式计算所得，分别相当于人临床剂量的1/2、1、2倍），Sham组和Model组分别腹腔注射给予生理盐水，给药频次均为1次/日，疗程4周。

1.4.2 大鼠心功能指标检测

治疗完成后，随机取每组8只大鼠，腹腔注射水合氯醛溶液（0.35 mg/kg）进行麻醉后，通过多普勒超声仪，取左室短轴解剖位M模式图像，检测大鼠心功能指标[LVEF和左室短轴缩短率（LVFS）]；通过生理信号采集系统检测心功能指标[左室内压最大上升速率和最大下降速率（+dp/dtmax、-dp/dtmax）]。

1.4.3 ELISA法检测血清cTnI、Ang Ⅱ、ALD水平

经腹主动脉采血5 mL并离心（1 500 r/min，离心半径10 cm，5 min）取血清，遵照试剂盒操作说明，采用ELISA法检测血清cTnI、Ang Ⅱ、ALD水平。

1.4.4 计算左室心肌肥厚指数（LVHI）

称量大鼠体质量（M1），开胸取心脏，剪取左心室心肌用生理盐水冲洗干净后称质量（M2），LVHI（%）=（M2/M1）×100%。

1.4.5 HE、TUNEL、Masson染色法观察心肌组织病理学改变、细胞凋亡和组织纤维化状况

取左心室缺血区心肌组织，经4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片、展片、烤片等处理后，按照各试剂盒操作说明：1）行HE染色后显微镜下观察心肌组织病理学改变。2）行TUNEL染色后观察心肌细胞凋亡状况（细胞核黄褐色为阳性着色），400倍光学显微镜下取每张切片5个互不重叠的视野，计数视野内凋亡细胞数和细胞总数，凋亡指数（AI）=（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。3）行Masson染色后观察心肌组织纤维化状况（蓝色为胶原着色），400倍光学显微镜下拍取5个互不重叠的视野，通过Image J软件分析视野内蓝色胶原纤维面积和视野总面积，胶原容积分数（CVF）=（蓝色胶原纤维面积/视野总面积）×100%。

1.4.6 透射电子显微镜观察心肌细胞线粒体超微结构变化

取每组剩余的8只大鼠，颈椎脱臼处死后开胸取心脏，剪取少量左心室心肌修饰成1 mm³小块后行2.5%戊二醛3 h和1%锇酸1 h双固定，脱水和丙酮置换后环氧树脂包埋，50 nm超薄切片后行醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，通过透射电子显微镜观察心肌细胞线粒体超微结构。

1.4.7 分光光度法检测心肌组织T-SOD、GSH-Px活性和MDA、ROS含量

取部分左心室缺血区心肌组织加入适量4 ℃生理盐水研磨匀浆，离心（3 500 r/min，离心半径10 cm，5 min）取上清液，遵照试剂盒操作说明，通过紫外-可见分光光度计检测心肌组织T-SOD活性（检测波长560 nm）、GSH-Px活性（检测波长340 nm）、MDA含量（检测波长535 nm）；通过荧光分光光度计检测心肌组织ROS含量（激发波长502 nm，发射波长530 nm）。

1.4.8 RT-PCR法检测心肌组织Nrf2、HO-1 mRNA表达

取适量左心室缺血区心肌组织，TRIzol法提取总RNA，按试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA后行PCR扩增，引物序列：Nrf2上游引物5’-TGACAATGAGGTTTCTTCGGCTACG-3’，下游引物5’-TGCCCCTGAGATGGTGACAA -3’，扩增长度112 bp；HO-1上游引物5’-GGCCTCCCTGTACCACATCT-3’，下游引物5’-CTGCA TGGCTGGTGTGTAGG-3’，扩增长度173 bp；β-actin上游引物5’-CTGTGTTG TCCCTGTATGCC TCTG’，下游引物5’- GGAACCG CTCATTGCCGATAGTG -3’，扩增长度116 bp。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，重复40个循环。以β-actin为内参，运用公式2^-ΔΔCt计算Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量。

1.4.9 Western Blot法检测心肌组织Nrf2、HO-1蛋白表达

取100 mg左心室缺血区心肌组织加入1 mL RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量后，30 μg总蛋白量上样、凝胶电泳分离蛋白、转PVDF膜、5%蛋白封闭液室温封闭2 h后，加目标蛋白一抗稀释液Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）和内参蛋白稀释液β-actin（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，洗膜后加二抗稀释液IgG（1∶2 000）室温孵育1 h，洗膜后加ECL显影，通过蛋白条带灰度值半定量目标蛋白相对表达量。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件行统计分析。计量资料符合正态分布以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠心功能指标比较

与Sham组比较，Model组大鼠LVEF、LVFS、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著降低（P < 0.05）。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组LVEF、LVFS、+dp/dtmax、-dp/dtmax（CWJI-L组除外）显著升高（P < 0.05），CWJI各剂量组间上述效应呈剂量依赖性（P < 0.05）。与CPT组比较，CWJI-H组LVEF、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著升高（P < 0.05），两组间LVFS差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

2.2 各组大鼠血清cTnI、Ang Ⅱ、ALD水平比较

与Sham组比较，Model组大鼠血清cTnI、Ang Ⅱ、ALD水平显著升高（P < 0.05）。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组血清cTnI、Ang Ⅱ、ALD水平显著降低（P < 0.05），CWJI各剂量组间上述效应呈剂量依赖性（P < 0.05）。与CPT组比较，CWJI-H组cTnI、Ang Ⅱ、ALD水平显著降低（P < 0.05）。见表 2。

2.3 各组大鼠LVHI比较

与Sham组比较，Model组大鼠LVHI显著升高（P < 0.05）。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组LVHI显著降低（P < 0.05），CWJI各剂量组间上述效应呈剂量依赖性（P < 0.05）。与CPT组比较，CWJI-H组LVHI显著降低（P < 0.05）。见表 3。

2.4 各组大鼠心肌组织病理学改变比较

Sham组大鼠心肌组织形态和细胞结构均未见异常。Model组心肌组织可见明显的病理学改变，如心肌纤维断裂，细胞排列紊乱、空泡变性、坏死、消失，结缔组织增生，间质区水肿、巨噬细胞及中性粒细胞浸润等炎性细胞浸润。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组心肌组织病理学改变均明显改善，CWJI各剂量组改善效果呈剂量依赖性，且CWJI-H组效果优于CPT组。见图 1。

2.5 各组大鼠心肌细胞凋亡状况及AI比较

Sham组心肌组织可见少量散在分布的凋亡细胞。Model组心肌细胞凋亡数量较Sham组明显增多。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组心肌细胞凋亡数量明显减少，CWJI各剂量组上述效应呈剂量依赖性，且CWJI-H组优于CPT组。与Sham组比较，Model组AI显著升高（P < 0.05）。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组AI显著降低（P < 0.05），CWJI各剂量组对AI的作用呈剂量依赖性（P < 0.05）。与CPT组比较，CWJI-H组AI显著降低（P < 0.05）。见图 2、表 3。

2.6 各组大鼠心肌组织纤维化状况及CVF比较

Sham组心肌组织可见生理状态下极少量丝状的胶原纤维分布。Model组心肌组织间质区和血管壁周围可见大量条索状胶原纤维沉积，部分融合成片状。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组胶原纤维沉积状况明显减轻，CWJI各剂量组效应呈剂量依赖性，且CWJI-H组优于CPT组。与Sham组比较，Model组CVF显著升高（P < 0.05）。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组CVF显著降低（P < 0.05），CWJI各剂量组对CVF的作用呈剂量依赖性（P < 0.05）。与CPT组比较，CWJI-H组CVF显著降低（P < 0.05）。见图 3、表 3。

2.7 各组大鼠心肌细胞线粒体超微结构变化比较

Sham组大鼠左心室心肌细胞线粒体形态结构均未见异常。与Sham组比较，Model组可见肌原纤维紊乱，线粒体空泡化、肿胀、破裂，嵴断裂或者减少，可见线粒体自噬体。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组心肌细胞线粒体上述病变明显改善，CWJI各剂量组效果呈剂量依赖性，且CWJI-H组效果优于CPT组。见图 4。

2.8 各组大鼠心肌组织T-SOD、GSH-Px活性和MDA、ROS含量比较

与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织T-SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA、ROS含量显著升高（P < 0.05）。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组T-SOD、GSH-Px活性显著升高，MDA、ROS含量显著降低（P < 0.05）；CWJI各剂量组间上述效应呈剂量依赖性（P < 0.05）。与CPT组比较，CWJI-H组T-SOD、GSH-Px活性显著升高，MDA、ROS含量显著降低（P < 0.05）。见表 4。

2.9 各组大鼠心肌组织Nrf2、HO-1 mRNA表达比较

与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织Nrf2、HO-1 mRNA表达量显著降低（P < 0.05）。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组Nrf2、HO-1表达量显著升高（P < 0.05）；CWJI各剂量组间上述效应呈剂量依赖性（P < 0.05）。与CPT组比较，CWJI-H组Nrf2、HO-1表达量显著升高（P < 0.05）。见表 5。

2.10 各组大鼠心肌组织Nrf2、HO-1蛋白表达比较

与Sham组比较，Model组大鼠心肌组织Nrf2、HO-1蛋白表达量显著降低（P < 0.05）。与Model组比较，CPT组和CWJI-L、CWJI-M、CWJI-H组Nrf2（CWJI-L组除外）、HO-1蛋白表达量显著升高（P < 0.05）；CWJI各剂量组间上述效应呈剂量依赖性（P < 0.05）。与CPT组比较，CWJI-H组Nrf2、HO-1蛋白表达量显著升高（P < 0.05）。见图 5、表 6。

3 讨论

CWJI是由刺五加水醇提取物制成的一种中药注射剂，主要成分包括刺五加苷D、刺五加苷E、异嗪皮啶、咖啡酸、绿原酸等，具有较好的抗氧化、抗凋亡等药理学作用^[9-10]。本研究探讨了CWJI对HF-AMI大鼠心肌组织的影响及相关机制，结果显示，CWJI可剂量依赖性提高HF-AMI大鼠LVEF、LVFS、+dp/dtmax、-dp/dtmax，提示CWJI具有改善HF-AMI大鼠心功能的作用，与李影雄等^[11]报道相似。HE、TUNEL染色结果显示，HF-AMI模型大鼠心肌组织可见心肌纤维断裂，细胞空泡变性、数量减少，结缔组织增生，间质区水肿、炎性细胞浸润等病理学改变，以及大量心肌细胞凋亡，与顾峥等^[12]研究结果一致；线粒体是细胞能量代谢的场所，对维持细胞生理状态及新陈代谢具有重要作用，本研究发现HF-AMI模型大鼠心肌线粒体呈现空泡化、肿胀、破裂，嵴断裂或者减少，自噬体形成等超微结构改变，与Cheng等^[13]研究结果一致。CWJI可剂量依赖性改善HF-AMI大鼠心肌组织病理学改变、细胞凋亡和线粒体结构改变，并且CWJI-H组效果优于CPT组，提示CWJI具有减轻HF-AMI大鼠心肌组织损伤的作用。

氧化应激和心肌组织纤维化是HF-AMI发生和进行性加重的重要原因，并且心肌组织纤维化与氧化应激密切相关。AMI发生后线粒体结构和功能受损导致氧化呼吸链电子传递受阻，致使大量活性氧簇（ROS）生成，过度消耗内源性ROS还原性清除酶T-SOD、GSH-Px等，导致ROS蓄积而引发氧化应激，损伤线粒体脊结构、线粒体膜等，并破坏细胞膜、核酸、结构蛋白等引发细胞凋亡^[14-15]。心室重构是HF-AMI的病理基础，而心肌纤维化是导致心室重构的关键，血清cTnT水平能够敏感地反映心肌损伤程度，而Ang Ⅱ、ALD水平能够反映心肌纤维化及心室重构状况^[16]。ROS可刺激心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，分泌大量细胞外基质（ECM）而促进心肌组织纤维化病变^[17]。Nrf2是哺乳动物细胞内广泛存在的一种核转录因子，可诱导T-SOD、GSH-Px等抗氧化酶和下游靶蛋白HO-1转录表达，HO-1具有催化血红素降解的生理学作用，降解产物中Fe²⁺、胆绿素等均具有较好的抗氧化作用，从而提高机体抗氧化能力^[18-19]。本研究发现，CWJI可剂量依赖性降低HF-AMI大鼠血清cTnI、Ang Ⅱ、ALD水平，改善心肌组织纤维化状况，提高T-SOD、GSH-Px活性并降低MDA、ROS含量，提高Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达量，并且CWJI-H组效果优于CPT组，提示CWJI具有抑制HF-AMI大鼠心肌组织纤维化和氧化应激的作用，激活Nrf2/HO-1信号通路可能是其重要的作用机制。与纪新博等^[20]报道相似。

综上，CWJI可减轻HF-AMI大鼠心肌组织病变、细胞凋亡、组织纤维化和线粒体超微结构病变，改善心功能，其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路，抑制氧化应激有关。本研究结果为CWJI作为HF-AMI治疗备选药物提供了理论依据，但其作用机制尚需深入研究。