肺炎是一种常见的下呼吸道疾病，主要由病毒感染、细菌或真菌病原体引起，在世界范围内具有较高的发病率和病死率^[1]。肺炎广泛发病于儿童中，主要是由于儿童免疫力低下和呼吸道解剖结构的缺陷，其高发病率和复发率可引起各种严重并发症和预后不良，严重影响儿童发育和生命健康^[2]。因此，确定儿童肺炎的潜在发病机制，开发新的治疗策略来抑制肺炎的进展非常重要。革兰氏阴性菌中的脂多糖（LPS）是一种有效的炎症内毒素，可导致各种器官如肺部炎症性疾病的发生，LPS通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子-κB（NF-κB）通路来促进和扩增炎症介质的表达，而过度的炎症浸润导致肺炎进一步加重^[3]。研究发现，通过下调NF-κB/MAPK通路可减弱急性肺炎体外模型的炎症反应^[4]。藏红花素（CRO）具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗细胞凋亡和心脏保护等多种生物活性，CRO对肺纤维化大鼠模型中的肺部炎症和肺血管功能障碍有减轻作用^[5]。CRO还能通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路发挥对脓毒症诱导的肝、肾和肺损伤的保护作用^[6]。而CRO能否通过调节MAPK/NF-κB信号通路发挥幼年肺炎小鼠的保护作用，尚不清楚。本研究通过构建幼年小鼠肺炎模型，探究CRO的治疗作用及其分子机制。

1 材料与方法 1.1 实验材料

SPF级C57BL/6小鼠80只，购自武汉贝赛模式生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（鄂）2022－0029，3~4周龄，适应性喂养1周，饲养环境温度22 ℃左右，湿度55 %，12 h光暗循环，不禁水食。本研究通过动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

CRO（纯度≥98 %）、白细胞介素（IL）-1β酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）；LPS、髓过氧化物酶（MPO）（北京索莱宝公司）；地塞米松（DEX，福州海王福药制药有限公司）；MAPK激活剂（Anisomycin，美国MedChemExpress公司）；ELISA试剂盒：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6（上海酶联生物公司）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（上海翌圣生物公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、吉姆萨染色试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）；二抗辣根酶标记山羊抗兔（美国Abcam公司）；一抗p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）和β-actin抗体（赛默飞世尔科技公司）。全自动酶标仪（奥地利TECAN公司）；显微镜（日本尼康公司）。

1.3 实验方法 1.3.1 小鼠分组、建模和药物干预

将小鼠随机分为对照组、模型组、DEX（阳性对照）组、CRO低剂量组、CRO中剂量组、CRO高剂量组、Anisomycin组（CRO高剂量+MAPK激活剂Anisomycin），每组10只。其中DEX组小鼠以2 mg/kg灌胃^[7]，CRO低、中、高剂量组分别以25、50、100 mg/kg灌胃^[8]、Anisomycin组在CRO 100 mg/kg基础上加Anisomycin 2 mg/kg灌胃^[9]，对照组和模型组灌胃相同剂量生理盐水，每天1次，连续给药1周。除对照组外，其余小鼠最后1次药物干预1 h后，参照文献[10]采用腹腔注射LPS（5 mg/kg）构建肺炎模型，对照组注射相同剂量生理盐水。24 h后小鼠出现呼吸频率增快、精神萎靡、活动减少等症状表明模型构建成功，对造模不成功或出现死亡的各组小鼠共10只及时补充。

1.3.2 样本采集

各组小鼠造模72 h后，眼球取血，离心取上清液-80 ℃保存；麻醉处死小鼠，取5只小鼠手术暴露气管并插管，用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，获得肺泡灌洗液（BALF），离心取上清液-80 ℃保存；剩余5只小鼠分离肺组织，取小鼠左肺测量湿/干（W/D）比，右肺上叶进行HE染色，其余肺组织-80 ℃保存进行蛋白免疫印迹（Western Blot）检测。

1.3.3 肺W/D比

取小鼠左肺，擦净肺组织表面液体后称质量以获得湿质量，后将肺组织置于80 ℃的烘箱中48 h至质量稳定，再次称取获得干质量，W/D比由湿质量与干质量之比计算。

1.3.4 HE染色观察肺部组织病理变化及病理损伤评分

取小鼠右上叶肺生理盐水洗净，4 %多聚甲醛固定、石蜡包埋，制备肺切片（4 μm），脱蜡后HE染色，脱水封片在电子显微镜下观察肺部组织病理学变化并拍照。并进行肺组织病理损伤评分，根据以下参数进行评分：1）有无出血。2）水肿程度。3）肺泡充血，中性粒细胞在空隙空间或血管壁聚集。4）肺泡壁厚度/透明膜形成。分别记为0~4分，分数越高损伤程度越重。

1.3.5 MPO活性检测

取-80 ℃肺组织并准确称质量，并将组织在反应缓冲液中均质化（质量/体积比=1∶19），然后按照MPO试剂盒说明检测肺组织的MPO活性，测定450 nm处吸光度变化。

1.3.6 BALF中细胞计数

取-80 ℃保存的BALF，采用血细胞计数器和吉姆萨染色进行计数总细胞、中性粒细胞和白细胞。

1.3.7 血清和BALF中炎症因子

取-80 ℃保存的血清和BALF，按照ELISA试剂盒说明书，检测炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

1.3.8 血清和BALF中MDA、SOD水平

取-80 ℃保存的血清和BALF，按照试剂盒说明书，检测炎性因子MDA、SOD的水平。

1.3.9 Western Blot检测蛋白表达

取-80 ℃保存幼年小鼠肺组织，用RIPA裂解，提取总蛋白，用BCA试剂盒进行浓度定量，按步骤将蛋白SDS-PAGE电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，在4 ℃下加入一抗p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）过夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL发光显影，观察拍照，各条带灰度值用Image J软件处理分析。

1.4 统计学处理

数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料统计描述用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组小鼠W/D比和MPO活性变化

与对照组比较，模型组小鼠肺W/D比、MPO活性显著升高（P < 0.05）；与模型组比较，DEX组和CRO低、中、高剂量组肺W/D比、MPO活性显著下降（P < 0.05），DEX组与CRO高剂量组间差异无统计学意义（P > 0.05）；与CRO高剂量组比较，Anisomycin组肺W/D比、MPO活性显著升高（P < 0.05）。见表 1。

2.2 各组小鼠肺组织病理学变化及病理损伤评分

对照组小鼠肺结构完整，无炎症、水肿、出血，未见炎性细胞浸润；模型组小鼠出现肺组织损伤，肺泡壁有增厚融合，水肿破裂的肺泡充满红血球，肺间质有炎性细胞浸润，病理损伤评分显著升高（P < 0.05）；DEX组和CRO低、中、高剂量组小鼠肺组织病理损伤减轻，少量炎性细胞浸润，DEX组与CRO高剂量组改善效果相似，病理损伤评分显著下降（P < 0.05）；Anisomycin组相比于CRO高剂量组，肺部病理损伤加重，病理损伤评分显著升高（P < 0.05）。见图 1和表 2。

2.3 各组小鼠BALF中细胞计数

与对照组比较，模型组小鼠总细胞、中性粒细胞和白细胞计数显著升高（P < 0.05）；与模型组比较，DEX组和CRO低、中、高剂量组总细胞、中性粒细胞和白细胞计数显著下降（P < 0.05），DEX组与CRO高剂量组间差异无统计学意义（P > 0.05）；与CRO高剂量组比较，Anisomycin组总细胞、中性粒细胞和白细胞计数显著升高（P < 0.05）。见表 3。

2.4 各组小鼠血清和BALF中炎症因子比较

与对照组比较，模型组小鼠血清和BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高（P < 0.05）；与模型组比较，DEX组和CRO低、中、高剂量组血清和BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著下降（P < 0.05），DEX组与CRO高剂量组间差异无统计学意义（P > 0.05）；与CRO高剂量组比较，Anisomycin组血清和BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高（P < 0.05）。见表 4。

2.5 各组小鼠血清和BALF中MDA、SOD水平比较

与对照组比较，模型组小鼠血清和BALF中MDA水平显著升高，SOD水平显著下降（P < 0.05）；与模型组比较，DEX组和CRO低、中、高剂量组血清和BALF中MDA水平显著下降，SOD水平显著升高（P < 0.05），DEX组与CRO高剂量组间差异无统计学意义（P > 0.05）；与CRO高剂量组比较，Anisomycin组血清和BALF中MDA水平显著升高，SOD水平显著下降（P < 0.05）。见表 5。

2.6 各组小鼠MAPK/NF-κB通路蛋白表达比较

与对照组比较，模型组小鼠p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα显著升高（P < 0.05）；与模型组比较，DEX组和CRO低、中、高剂量组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα显著下降（P < 0.05），DEX组与CRO高剂量组间差异无统计学意义（P > 0.05）；与CRO高剂量组比较，Anisomycin组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα显著升高（P < 0.05）。见图 2和表 6。

3 讨论

由于儿童的气道纤毛和免疫系统尚未发育完全，呼吸道经常暴露在碳颗粒、病毒和其他刺激物中，很容易引起肺炎等呼吸道疾病，严重影响患儿的生长发育，造成沉重的经济和社会负担^[2]。LPS与许多肺部炎症性疾病的发展有关，可刺激呼吸系统的免疫功能，引起急、慢性炎症反应，导致肺损伤、肺气肿、气道重塑等病理改变，影响儿童肺发育^[11]。以往的研究主要是针对中老年呼吸系统疾病，而关于儿科呼吸系统疾病研究相对较少。本研究通过LPS法构建幼年小鼠肺炎模型，选用3~4周龄小鼠，其免疫功能和组织修复功能弱，肺部发育与人类的童年早期相似，为探究儿童肺炎的机制及临床应用奠定基础。本研究结果显示，模型组小鼠出现肺组织损伤，肺泡水肿出血，大量炎性细胞浸润，肺W/D比和病理损伤评分显著升高，表明肺炎小鼠模型构建成功。模型组小鼠BALF中总细胞、中性粒细胞和白细胞计数显著升高，且血清和BALF中TNF-α、IL-lβ、IL-6、MDA水平显著升高，SOD水平显著降低，表明LPS诱导炎症因子和氧化应激反应，多种炎症因子又通过激活中性粒细胞和巨噬细胞活化，进一步导致肺部炎症发生。

CRO已被证实能通过发挥抗氧化、抗炎等作用对肺部炎症损伤起到保护作用，不仅可通过抑制炎症信号通路来缓解LPS诱导的急性呼吸窘迫综合征和肺损伤^[12]；还通过发挥对白细胞和淋巴细胞的免疫调节作用，降低卵清蛋白致敏小鼠肺部炎症^[8]。本研究发现，CRO干预后小鼠肺组织病理损伤减轻，少量炎性细胞浸润，肺W/D比和病理损伤评分、BALF中总细胞、中性粒细胞和白细胞计数以及血清和BALF中炎症因子和MDA水平显著降低，SOD水平显著升高，表明CRO具有减轻小鼠肺炎的功效，主要是通过发挥抗炎、抗氧化、免疫调节作用。本研究还选用DEX作为阳性药物，其对小鼠肺炎损伤的改善效果与CRO高剂量组效果相似，说明CRO对LPS诱导的肺炎具有很好的改善效果。

MAPK作为介导基本生物学过程和细胞对外部应激的信号分子，可被各种炎症和应激刺激激活来调节免疫应答，p38 MAPK通路作为MAPK信号传导的纽带，与炎症密切相关，在TNF-α、IL-1β和IL-6的产生中起重要作用^[13]。且MAPK是NF-κB的上游激活剂，p38 MAPK在NF-κB向细胞核的活化和迁移中起重要作用，可通过激活NF-κB促进促炎介质的表达。正常情况下，NF-κB以非活性状态与IκB结合的状态存在于细胞质中，LPS刺激增加MAPK的磷酸化，导致NF-κB活化并以p65活性形式易位到细胞核中，增加促炎细胞因子表达和过度炎症反应的发生^[14]。Wang等^[15]研究发现抑制p38 MAPK可缓解肺缺血再灌注损伤，可能是治疗急性肺损伤的有效方法。Yu等^[16]也发现使用NF-κB抑制剂可改善炎症，进而预防LPS诱导的急性肾损伤和肺损伤。还有研究表明，抑制MAPK/NF-κB信号通路可以减少肺部炎症和血管重塑，并减轻LPS诱导的急性肺损伤^[17]。本研究发现，模型组小鼠p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα表达显著升高，表明LPS刺激可能激活MAPK/NF-κB信号通路。而CRO干预后p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα表达降低，表明CRO可能具有抑制MAPK/NF-κB激活的作用。这与CRO通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路发挥对脓毒症诱导的肝、肾和肺损伤的保护作用，以及抑制NF-κB信号传导来减轻心肌纤维化中的氧化应激、炎症和细胞凋亡^{[6, 18]}结果相似，为进一步验证CRO对MAPK/NF-κB信号通路的干预作用，本研究在CRO高剂量组的基础上加上MAPK激活剂Anisomycin，CRO对LPS诱导的肺炎小鼠的改善作用受到抑制，因此猜测CRO的作用机制可能与抑制MAPK/NF-κB信号通路的激活有关。

综上，CRO可能通过抑制MAPK/NF-κB通路激活，减少炎症反应和氧化应激，对LPS诱导的肺炎小鼠肺部损伤有治疗作用。本研究为改善幼年肺炎小鼠提供了新思路，但仅初步探讨CRO对幼年肺炎小鼠的治疗作用，后续将进一步探讨CRO对成年小鼠的治疗作用以及研究药物与年龄的相关性。