2023, Vol. 40文章信息
- 陈萌萌, 邢春花.
- CHEN Mengmeng, XING Chunhua.
- 白藜芦醇调控SDF-1/CXCR4通路对颞下颌关节骨关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡的影响
- Impact of resveratrol on chondrocyte apoptosis in temporomandibular joint osteoarthritis model rats by regulating SDF-1/CXCR4 pathway
- 天津中医药, 2023, 40(12): 1615-1620
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2023, 40(12): 1615-1620
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2023.12.18
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文章历史
- 收稿日期: 2023-08-16
2. 哈尔滨市第四医院检验科, 哈尔滨 150026
骨关节炎是一种进行性退行性疾病，常导致软骨和周围组织恶化，引起关节疼痛和功能障碍，颞下颌关节是受骨关节炎影响的最常见部位之一[1]。颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）的特征包括进行性软骨变性，软骨下骨重塑异常和滑膜炎，并伴随咀嚼困难、疼痛及颌面部畸形等症状[2]。软骨细胞作为软骨的常驻细胞，是维持软骨基质稳态的关键介质，其细胞凋亡和功能损伤会破坏软骨的稳态，加速骨关节炎的进程[3]。因此，研究软骨细胞的凋亡机制对TMJOA的治疗有重要意义。基质细胞衍生因子-1（SDF-1）属于α趋化因子家族，是一种小分子量的趋化因子蛋白。CXC趋化因子受体4（CXCR4）在多种组织和器官中广泛表达，是SDF-1的唯一特异性受体。当SDF-1与CXCR4特异性结合时，可以发挥多种生物学功能[4]。最近有研究显示，SDF-1/CXCR4在骨关节炎的发展中发挥重要作用，阻断SDF-1/CXCR4信号通路能够抑制TMJOA的成骨分化，减轻软骨损伤[5-6]。白藜芦醇（RES）是天然的多酚类物质，是植物在胁迫下产生的一种植物抗毒素，具有抗癌、抗氧化、抗炎等特性。前期有研究发现RES可以有效改善炎症损伤防止骨关节炎发展，减轻白细胞介素-1β诱导的软骨细胞损伤，同时也可以通过下调TMJOA中的环氧化物酶2（COX-2）/核因子κB（NF-κB）信号通路，抑制软骨细胞凋亡[7-8]。但有关细胞增殖和炎症诱导COX-2的机制还尚未得到证实。另一项研究显示，COX-2是SDF-1/CXCR4轴下游信号通路的重要成员之一，SDF-1能够增强COX-2的表达[9]。因此，本研究探讨了RES是否能够通过调控SDF-1/CXCR4信号通路来抑制TMJOA大鼠的软骨细胞凋亡，为RES成为TMJOA的治疗策略提供更充分的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级Wistar大鼠36只，6周龄，（160±20）g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0002。实验前将所有大鼠置于温度26 ℃，湿度60%的环境中饲养。
1.1.2 主要试剂白藜芦醇（HPLC≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司）；AMD3100（货号：HY-10046，美国MedChemExpress公司）；重组SDF-1（货号：ab9798，英国Abcam公司）；苏木精-伊红（HE）染色液、改良番红O-固绿软骨染色液（货号：SY2022、SY1418，北京伊塔生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（货号：FY600003-20T，弗元生物科技有限公司）；一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）、细胞色素C（Cyt C）酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（货号：XY-ELISA0380、XY-SJH-2984、XY-SJH-3050，上海烜雅生物科技有限公司）；caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4兔单抗（货号：ab32539、ab182858、ab32503、ab155090、ab124824，英国Abcam公司）；山羊抗兔lgG（H+L）（货号：AP31L014，和元李记生物技术有限公司）。
1.2 方法 1.2.1 TMJOA大鼠模型建立和分组处理将所有大鼠随机分为对照组、模型组、CXCR4抑制剂组（AMD3100组）、RES低剂量组、RES高剂量组、RES高剂量+重组SDF-1组（RES高+SDF-1组），每组6只。除对照组，其余组均通过在大鼠颞下颌关节上腔内注射12.5 μL胶原酶建立TMJOA模型[8]。1周后，AMD3100组关节腔内注射40 μL浓度为1 μg/μL的CXCR4抑制剂AMD3100[6]；RES低、高剂量组关节腔内分别注射80 μL浓度为1.25、12.5 μg/μL的RES[10]，RES高+重组SDF-1组先注射80 μL浓度为12.5 μg/μL的RES，再注射剂量为30 μg/kg的重组SDF-1，对照组和模型组用相同方式注射等量的生理盐水，每周注射3次，持续4周。
1.2.2 细胞分离和培养干预结束后，每组随机选取3只大鼠用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉并处死，取颞下颌关节，用手术刀片轻轻刮取髁突软骨组织层，然后将软骨组织用无菌生理盐水清洗，并剪成体积小于1 mm3的碎块儿，用0.1% Ⅱ型胶原酶在37 ℃下消化5 h，然后吹打过滤后，2 000×g离心10 min，离心半径10 cm，收集细胞用含有10%胎牛血清DEME培养基培养，24 h后再次收集细胞立即进行后续实验。
1.2.3 组织学染色观察软骨组织病理学变化按照1.2.2中的方法收集每组剩余大鼠的髁突软骨组织，放入4%多聚甲醛中固定过夜，然后进行石蜡包埋并切片。接着按照常规步骤用二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化，然后将组织切片分别放入HE染色液和番红O-固绿染液中染色20 min，再次使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树脂封片。在光学显微镜下观察髁突软骨组织结构形态和基质蛋白多糖的变化，并参考文献[11]中Mankin评分标准来评估软骨组织损伤情况。
1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡将1.2.2中收集的软骨细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，分别加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（PI），室温避光孵育15 min。用流式细胞仪分析细胞凋亡情况并计算细胞凋亡率。
1.2.5 ELISA检测细胞中iNOS、NO、Cyt C的水平将1.2.2中收集的软骨细胞，加入PBS重悬后，4℃，2 000×g离心10 min，离心半径10 cm，收集上清液。然后按照ELISA试剂盒的操作步骤检测软骨细胞中iNOS、NO、Cyt C的含量。
1.2.6 蛋白免疫印迹分析（Western Blot）检测软骨细胞中caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4蛋白表达将1.2.2中收集的软骨细胞置于玻璃匀浆器中，加入蛋白裂解液匀浆，离心收集上清液，用BCA测定蛋白浓度。然后用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白并转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶将PVDF膜在4 ℃下封闭过夜，随后加入一抗稀释液（caspase-9、Bcl-2、Bax比例1∶1 000，SDF-1比例1∶10 000，CXCR4比例1：100），室温孵育2 h后加入羊抗兔IgG二抗稀释液（1∶500）中，室温孵育2 h，最后用ECL显影。以GAPDH为内参蛋白，用凝胶成像仪和Image J软件观察并分析蛋白条带灰度值。
1.3 统计学分析本研究数据均采用Graphpad prism8.0软件统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠软骨组织的病理学变化对照组髁突软骨组织结构层次清晰，软骨细胞排列整齐，软骨着色均匀，主要着色部位在软骨浅层；与对照组比较，模型组软骨组织层次紊乱，细胞数量减少，软骨着色明显减退，组织损伤评分增加（P＜0.05）；与模型组比较，AMD3100组和RES组软骨组织结构层次逐渐明显，细胞数量增多，软骨着色增加，组织损伤评分减少（P＜0.05）；与RES高剂量组比较，RES高+SDF-1组软骨组织的病理变化与模型组相似，组织损伤评分增加（P＜0.05），见图 1和表 1。
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| 注：A.对照组；B.模型组；C. AMD3100组；D. RES低剂量组；E. RES高剂量组；F.RES高+SDF-1组。 图 1 HE和番红O-固绿染色检测各组大鼠软骨组织损伤情况（×100） Fig. 1 HE and saffron O-fast green staining were used to detect the damage of cartilage tissue in rats in each group (×100) |
与对照组比较，模型组软骨细胞凋亡率增加（P＜0.05）；与模型组比较，AMD3100组和RES组软骨细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与RES高剂量组比较，RES高+SDF-1组软骨细胞凋亡率增加（P＜0.05），见图 2和表 2。
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| 注：A.对照组；B.模型组；C. AMD3100组；D. RES低剂量组；E. RES高剂量组；F.RES高+SDF-1组。 图 2 流式细胞术检测各组大鼠软骨细胞凋亡 Fig. 2 Detection of chondrocyte apoptosis in each group of rats by flow cytometry |
与对照组比较，模型组软骨细胞中iNOS、NO、Cyt C含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，AMD3100组和RES组软骨细胞中iNOS、NO、Cyt C含量降低（P＜0.05）；与RES高剂量组比较，RES高+SDF-1组软骨细胞中iNOS、NO、Cyt C含量升高（P＜0.05），见表 3。
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与对照组比较，模型组软骨细胞中caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，AMD3100组和RES组软骨细胞中caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05）；与RES高剂量组比较，RES高+SDF-1组软骨细胞中caspase-9、Bax、SDF-1、CXCR4蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05），见图 3和表 4。
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| 注：A.对照组；B.模型组；C. AMD3100组；D. RES低剂量组；E. RES高剂量组；F.RES高+SDF-1组。 图 3 各组大鼠软骨细胞中caspase-9、Bcl-2、Bax、SDF-1、CXCR4蛋白表达条带 Fig. 3 Expression bands of caspase-9, Bcl-2, Bax, SDF-1 and CXCR4 in rat chondrocytes of each group |
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TMJOA是一种影响颞下颌关节最常见的慢性退行性关节炎疾病，主要特征是软骨细胞死亡、ECM降解和软骨下骨重塑。颞下颌关节髁突软骨变性与TMJOA的发展密切相关。软骨逐渐变性是由软骨细胞调节不当以及组织破坏与生成之间的不平衡引起的，髁突软骨细胞作为颞下颌关节髁突软骨中唯一的细胞类型，在软骨变性过程中起着决定性作用[12-13]。研究显示软骨细胞更新的增加引发了髁突软骨的退化，细胞凋亡和坏死性凋亡加速了关节软骨的破坏。软骨细胞的异常死亡不仅会减少软骨细胞的数量，还会引发软骨的退化和软骨下骨的破坏[14]。因此，抑制软骨细胞凋亡是保护软骨组织免受损伤的重要途径。本研究首先通过HE和番红O-固绿染色检测TMJOA髁突软骨组织的损伤情况，结果显示模型组软骨组织结构层次紊乱，细胞数量减少，软骨着色明显减退，损伤评分升高，揭示了TMJOA大鼠模型建立成功。而RES低、高剂量组软骨组织结构层次逐渐明显，细胞数量增多，软骨着色增加，损伤评分降低，揭示了RES可以缓解大鼠的软骨组织损伤。接着分离软骨细胞检测细胞凋亡情况，结果显示模型组细胞凋亡率高于对照组，RES低、高剂量组细胞凋亡率低于模型组，揭示了RES可以抑制TMJOA大鼠髁突软骨细胞的凋亡，减轻关节软骨的损伤。
钙在软骨细胞凋亡中也存在非常重要的作用，细胞内高浓度钙可以激活诱导型iNOS，从而诱导NO抑制线粒体呼吸，并通过释放Cyt C和caspase-9导致软骨细胞凋亡[15]。已知Bcl-2超家族成员也是细胞凋亡的关键调节者，该超家族可分为促凋亡和抗凋亡成员，促凋亡成员如Bax主要位于细胞质中，抗凋亡成员如Bcl-2本身主要定位于线粒体外膜[16]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组软骨细胞中iNOS、NO、Cyt C含量及Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低；而RES低、高剂量组iNOS、NO、Cyt C含量及Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达升高。揭示了RES可以抑制TMJOA大鼠髁突软骨细胞中的钙浓度及促凋亡因子的表达，从而抑制软骨细胞凋亡，减轻TMJOA的软骨损伤。
SDF-1是一种与炎症相关的细胞因子，在邻近关节软骨的滑膜中被发现，来自滑膜的外源SDF-1可以与软骨细胞膜上的G蛋白偶联受体CXCR4结合，随后进入软骨细胞并调节软骨细胞的增殖、存活、分化和成熟[17-18]。有研究证明SDF-1与CXCR4的结合通过诱导基质金属蛋白的分泌导致骨关节炎软骨细胞基质的降解，且SDF-1/CXCR4可诱导过度功能矫形引起的TMJOA成骨分化并导致软骨降解[6]。已知CXCR4的抑制剂AMD3100已有效用于治疗骨关节炎，也可以减轻碘乙酸钠诱导的TMJOA的严重程度[19-20]。因此，本研究将AMD3100作为阳性对照，结果显示，模型组软骨细胞中SDF-1和CXCR4的蛋白表达明显高于对照组，RES低、高剂量组细胞中SDF-1和CXCR4的蛋白表达明显低于模型组，AMD3100组细胞凋亡率、凋亡相关因子mRNA水平和SDF-1、CXCR4蛋白表达与RES高剂量组差异无统计学意义，揭示了RES可以抑制SDF-1与受体CXCR4结合，其作用与AMD3100作用一致。在RES高剂量的基础上进一步加入重组蛋白SDF-1，SDF-1表达的升高逆转了RES对信号通路以及软骨细胞凋亡的抑制作用。揭示了RES可能是通过阻断SDF-1/CXCR4信号通路来抑制TMJOA大鼠软骨细胞的凋亡。
综上所述，RES可以通过阻断SDF-1/CXCR4信号通路抑制TMJOA大鼠软骨细胞的凋亡。本研究为寻找治疗TMJOA的潜在药物提供了新思路和治疗策略。但骨关节炎中软骨细胞凋亡的机制比较复杂，因此RES对骨关节炎软骨细胞中的凋亡机制还有待进一步深入研究。
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2. Department of Laboratory Medicine, Harbin Fourth Hospital, Harbin 150026, China