藜芦（Veratrum nigrum L.）又名山葱、葱葵、丰芦等^[1]，是中国传统的中草药，富含生物碱、黄酮、有机酸等天然活性成分，具有降血压、抗肿瘤、抗氧化、抗炎镇痛等作用^[2-8]。甾体生物碱被认为是藜芦的活性物质基础，以芥芬胺、藜芦胺为代表成分^[9-11]。芥芬胺为介藜芦型生物碱，藜芦胺为藜芦胺型生物碱，均具备C-nor-D-homo-[14（13→12）-abeo]环系，A、B、D均为六元环，C为五元环，其相似的化学结构表征两者可能具有相同的药理活性^[12-18]。近年来对藜芦的提取分离、含量测定、配伍及药理作用的研究较多^[19-20]，提取工艺的讨论较为少见。文章对藜芦提取工艺进行优化研究，研究过程中引入了统计分析软件（JMP）实验设计模型，以验证正交实验数据的可行性与有效性。JMP软件是一种交互式可视化统计发现软件，其在医药行业中的用途有实验设计和数据的统计分析。工艺优化需考察多种因素及水平对工艺参数的影响，因此科学合理地设计实验、筛选关键影响因素对提供全面可靠的数据是十分重要的^[21-23]。研究以藜芦中芥芬胺和藜芦胺的含量作为评价指标，采用单因素实验、正交实验及JMP软件实验设计模型考察乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取次数4种因素对主要活性成分提取的影响，确定最佳提取工艺。

1 材料 1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AX 205型十万分之一（瑞士Mettler Toledo公司）天平；Milli-Q超纯水制备仪（Millipore公司）；3K15型高速离心机（美国sigma公司）；XW-80A型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 试药

甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国Fisher公司；甲酸为色谱纯，购自美国ROE公司；95%乙醇为分析纯，购自天津市康科德科技有限公司；对照品芥芬胺（批号：DST190407-087，HPLC≥98%）、藜芦胺（批号：DST190108-024，HPLC≥99%）由成都德思特生物技术有限公司提供；藜芦购自安徽亳州药材市场。

2 方法与结果 2.1 芥芬胺、藜芦胺含量测定 2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈；梯度洗脱：0~20 min，15%~35% B；20~25 min，35%~37% B；25~28 min，37%~95% B。检测波长：0~21.8 min，254 nm；21.8~28 min，205 nm。流速：0.5 mL/min，柱温：30 ℃；进样量：5 μL。结果见图 1。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取芥芬胺和藜芦胺对照品适量至5 mL的容量瓶中，分别以甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的对照品溶液，4 ℃冰箱储存备用。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称取藜芦粗粉（过2号筛）10 g，加入80%乙醇150 mL，加热回流提取2 h，回流提取2次，两次药液合并，4 ℃冰箱储存备用。

2.1.4 线性关系考察

精确量取“2.1.2”项下对照品溶液适量，以甲醇稀释至分别含有芥芬胺和藜芦胺500 μg/mL的混合对照溶液，将此溶液用甲醇依次稀释2、2.5、2、2、2.5、2、2、5倍得9个不同浓度的溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，以待测物峰面积（Y）为纵坐标，待测物的浓度（X）为横坐标，得芥芬胺峰、藜芦胺面积与浓度的线性关系分别为Y=23.102X-15.653，r²=0.999 1，0.5~500 μg/mL；Y=70.769X+139.630，r²=0.999 2，0.5~500 μg/mL。表明各成分线性关系良好。

2.1.5 精密度实验

精密吸取“2.1.4”项下混合对照品溶液适量，以甲醇稀释5倍后按“2.1.1”项下色谱条件测定连续进样测定6次，相对标准差（RSD）值分别为3.9%和2.2%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性实验

精密吸取“2.1.3”项下供试品溶液适量，按“2.1.1”项下方法于0、3、6、12、24 h测定芥芬胺和藜芦胺峰面积，24 h内RSD值分别为1.1%和1.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性实验

精密称取藜芦粗粉6份，每份10 g，以“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法测定芥芬胺和藜芦胺的含量，RSD值分别为2.8%和1.4%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率

精密称取藜芦粗粉6份，每份5 g，分别准确加入一定量的芥芬胺和藜芦胺对照品溶液，再加入80%乙醇至150 mL，按“2.1.3”项下方法制备并测定，计算芥芬胺和藜芦胺平均回收率分别为103.0%和98.8%，RSD为1.5%和2.7%。

2.2 单因素实验 2.2.1 乙醇体积分数

精密称取藜芦样品10 g，共4份，分别加入体积分数为50%、60%、70%、80%的乙醇，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1.1”项下色谱条件测定芥芬胺和藜芦胺含量。结果见图 2A，乙醇体积分数为60%时，芥芬胺含量最高，体积分数为70%时，藜芦胺含量最高，且芥芬胺含量未明显下降，故确定乙醇体积分数为60%、70%、80%。

2.2.2 液料比

精密称取藜芦样品10 g，共4份，分别加入提取溶液使得液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1.1”项下色谱条件测定芥芬胺和藜芦胺含量。结果见图 2B，液料比为20∶1时，藜芦胺含量最高，芥芬胺含量较高，且两者的含量总和最高，故确定液料比为10∶1、15∶1、20∶1。

2.2.3 提取时间

精密称取藜芦样品10 g，共4份，提取时间分别为1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1.1”项下色谱条件测定芥芬胺和藜芦胺含量。结果见图 2C，提取时间为1 h时芥芬胺与藜芦胺的提取含量总和最高，故确定提取时间为1 h、1.5 h、2 h。

2.2.4 提取次数

精密称取藜芦样品10 g，共3份，提取次数分别为1、2、3次，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定芥芬胺和藜芦胺含量。结果见图 2D，提取次数为3次时，芥芬胺和藜芦胺的提取效果最好，故确定提取次数为1、2、3次。

2.3 建立JMP实验设计模型 2.3.1 模型设计

基于单因素实验结果，采用JMP软件4因素3水平的定制设计筛选藜芦芥芬胺和藜芦胺含量的影响因素，因素水平设置见表 1。

2.3.2 预测结果

JMP软件设计出具有数据分析意义的实验列表，并对响应值进行模拟，模拟结果见表 2。结果表明，该模型预测A₁B₃C₃D₃实验条件下响应值最高，即乙醇体积分数60%，提取次数3次，提取时间2 h，液料比20∶1工艺条件下提取的芥芬胺与藜芦胺总量最高。

2.3.3 数据处理及模型拟合

应用JMP软件对表 2中的结果进行最小二乘法拟合分析，根据P值找出影响响应值的关键因素，P＜0.05为差异有统计学意义，结果见表 3。由表 3可知乙醇体积分数、提取次数、提取时间、液料比P值均大于0.05，表明4种因素均对提取工艺有影响，但并非影响提取含量的关键因素，模型预测结果需进一步验证。

2.4 正交实验

根据单因素实验结果，在乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取次数4因素下分别设置3水平，以芥芬胺和藜芦胺含量为考察指标进行L9（3⁴）正交实验，确定最佳提取工艺条件。因素水平设计见表 1。按照表 1进行4因素3水平正交实验，实验结果见表 4。提取工艺最优参数与JMP软件实验设计模型所得结果一致。

极差R_B > R_C > R_A > R_D，即影响藜芦提取物中芥芬胺和藜芦胺含量的主次因素为提取次数 > 提取时间 > 乙醇浓度 > 液料比，其结果与方差分析结果一致，见表 5。根据均值进行分析可得出藜芦提取的最佳工艺条件为A₂B₃C₃D₂，即乙醇体积分数70%，提取次数3次，提取时间2 h，液料比15∶1。

2.5 验证实验

精密称取藜芦样品3份，每份10 g，置入250 mL圆底烧瓶中，按优化工艺进行验证实验，即加入70%乙醇150 mL，回流提取3次，每次2 h，合并滤液后放置室温，补足失重，取上清液经0.45 μm有机微孔滤膜过滤后按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果显示芥芬胺和藜芦胺含量的平均值分别为1.60、2.98 mg/g，RSD分别为1.0%、1.1%。结果表明该工艺稳定可行。

2.6 等高线图分析

采用JMP软件对正交实验结果以标准最小二乘法回归分析，分析结果见表 6，参数估计值见表 7，模型与正交实验方差分析结果一致，表明正交实验结果真实有效^[23]。利用JMP软件在完成回归方程模型的基础上，借助等高线图直观反映各因素变化对考察指标的影响情况。本研究4种因素两两交互作用对芥芬胺、藜芦胺提取总含量的交互影响情况如图 3所示。等高线图将变量描绘在二维图表中，横纵坐标分别代表各自变量，等高线颜色指示含量与该关系的符合程度。图 3中显示本研究中各因素两两之间的相关性较弱，当其中1项变化时，另一项并不会随之变化^[24]，该结论提示正交实验结果有效，所确定工艺为最优提取工艺。

3 讨论

藜芦是中国传统中药，其化学成分复杂，包括生物碱类、黄酮类、二萜类、茋类等，具有多种药效^[2-8]。芥芬胺与藜芦胺为藜芦中主要生物碱型化合物，具有阻断声波刺猬（Shh）信号通路^[25]、信号转导抑制作用，是藜芦发挥药效作用的物质基础。

常用的生物碱提取方法有酸水提取法、亲脂性有机溶剂提取法、醇类溶剂提取法、超声提取法、酶提取法等。由于酸水提取法腐蚀性和成盐损耗大、亲脂性有机溶剂毒性高、超声或酶提取法造价高等缺陷，尚未广泛应用于大规模生产，乙醇提取法具有工艺简单、经济便捷、效率高等优点广受厂家青睐，因此本实验选用乙醇提取法。

为降低药效成分在生产过程中的损耗、优化提取效率、增强药效，实验在单因素控制条件下，共考察了影响芥芬胺和藜芦胺提取的4个因素：乙醇体积分数、提取时间、提取次数、液料比。同时分别设置了3水平，进行正交实验。根据正交实验结果得知，工艺为乙醇体积分数为70%，液料比为15∶1，提取3次，每次2 h，芥芬胺与藜芦胺含量最高，可达1.60、2.98 mg/g。同样可由表中数据得知，影响藜芦提取物中含量的主次因素为提取次数 > 提取时间 > 乙醇浓度 > 液料比。运用JMP软件定制设计实验模型，并对正交实验结果以标准最小二乘法回归分析，模型结果与正交实验结果一致，表明正交实验结果真实有效。同时在此基础上，借助等高线图直观反映各因素变化对考察指标的影响情况，全面立体地筛选最佳提取工艺。实验提取得到的芥芬胺与藜芦胺含量较高，工艺稳定，可为藜芦的进一步开发研究提供理论依据。