脑卒中是一种高致残率的神经系统损伤疾病，其中缺血性卒中，即脑梗死（CI），已成为中国脑卒中人群的主体，约占全部脑卒中的70%^[1]。研究发现内源性神经干细胞（eNSPCs）可通过恢复血脑屏障、减轻脑血管炎症、增加神经发生和血管生成等机制来改善卒中结局^[2]。针刺是治疗脑卒中的常用辅助疗法，可有效降低卒中患者的致残率和复发风险，研究表明电针可以促进CI后eNSPCs增殖，分化为新的神经元和神经胶质细胞，发挥脑保护作用^[3]。

课题组前期研究证实了电针人中穴（GV26）在促进血管新生方面的确切作用及机制^[4]，其通过有效促进CI急性期侧支循环的建立，重建神经血管单元，增加梗死区的脑血流供应，从而减轻CI神经元损伤。本实验通过观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）、eNSPCs特异性标识物齿状回巢蛋白（Nestin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达差异及针刺干预效应，探讨电针人中穴对eNSPCs增殖、分化这一神经再生修复过程的影响以及其动态变化规律，说明电针促进eNSPCs增殖和分化对神经再生修复、脑内结构功能重建的重要意义，为针刺治疗CI后的神经功能恢复提供重要的理论和实验依据。

1 材料与方法 1.1 动物

雄性SPF级Wistar大鼠，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2021-0006]。大鼠饲养于天津南开医院科研实验中心，温度（25±2）℃，湿度50%±5%，每12 h明暗交替，自由饮食水。实验过程中对动物的处置严格遵照中华人民共和国科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 仪器

MCAO线栓（中国，长沙迈越公司），动物麻醉机（中国，上海普辛公司），华佗牌无菌针灸针0.25 mm×13 mm、华佗牌SDZ-Ⅱ型电针仪（中国，苏州医疗用品厂），自动脱水机、石蜡包埋机（中国，金华科迪公司），切片机（德国，Leica公司），离心机（中国，北京离心机厂），恒温水浴箱（中国，江苏太仓公司），干燥箱（日本，松下三洋公司），孵育箱（中国，上海博迅公司），显微镜、CMOS图像传感器（日本，Olympus公司）。

1.3 药物及试剂

异氟烷（G45780，河北金达福公司），0.2%庆大霉素注射液（兽药字040831506，芮城县同仁兽药公司），BrdU、BSA、PBS、柠檬酸钠溶液，苏木素、伊红、DAPI染色液，封片剂（827M031、SW3015、P1010、C1010，G1140、G1120、K1062711C，G8590，北京索莱宝公司），4%多聚甲醛（BL539A，中国Biosharp公司），Nestin、BrdU、GFAP一抗（DF7754、BM0201、DF6040，北京沃卡威公司）；PE二抗（BK20160622，北京中杉金桥公司）。

1.4 动物模型制备及干预

大鼠适应性饲养1周后，78只Wistar大鼠随机分为电针、模型、假手术、空白组，前3组每组24只，按干预及取材时间分为1、3、7、14 d共4个亚组，每亚组6只，空白组6只。模型组和针刺组大鼠采用Longa线栓法制备大脑中动脉梗塞（MCAO）模型，线栓直径为0.205 mm。分别测量禁食8 h后的大鼠体质量，异氟烷吸入麻醉后，仰卧固定于手术台上，剃除颈部鼠毛，碘伏消毒皮肤。颈部正中偏右切开皮肤，钝性分离并充分暴露右侧的颈总、颈外及颈内动脉，结扎颈外动脉，颈总动脉近心端和分叉处放置动脉夹，在两动脉夹中间用1 mL注射器弯针头开一小口，轻柔插入线栓，进栓长度为（18±0.5）mm。结扎固定线栓及颈总动脉，颈部开口处滴入2滴0.2%庆大霉素注射液抗感染，缝合皮肤。假手术组仅分离及牵拉相应动脉，不行插栓及血管结扎操作，空白组不做任何干预。

针刺组于造模后即刻进行电针干预，0.25 mm×13 mm针灸针刺入人中穴（参照《大鼠穴位图谱的研制》^[5]定位），连续波，频率15 Hz，留针20 min，每日针刺1次。模型组和假手术组均在相同时点予抓取固定，但不进行任何治疗，各亚组干预时间分别为1、3、7、14 d。

1.5 行为学检测

采用神经功能缺损体征评分^[6]（NSS）评估大鼠神经功能，分别从感觉、运动、反射、平衡4方面进行神经功能综合评估，于干预1、3、7、14 d后记录NSS分值。总分0~18分，评分越低代表神经功能损伤程度越轻，0分为完全正常。

1.6 样本收集

大鼠取材时间点前24 h开始，每2 h腹腔注射BrdU（50 mg/1 kg）1次，共注射4次。麻醉后开胸，暴露心脏，0.9%氯化钠溶液及4%多聚甲醛（预冷）灌注后取出脑组织，放于4%多聚甲醛（预冷）固定液中固定6 h，按照常规方法进行组织脱水、石蜡包埋及连续石蜡切片（厚度为5 μm）。

1.7 苏木精-伊红（HE）染色法观察大鼠脑组织形态变化

将制备好的石蜡切片常规脱蜡、水化后浸入苏木素染色液5 min，纯水冲洗后浸入伊红染色液1~5 min，镜下观察着色情况，脱水干燥后中性树胶封片。在400倍视野下每张切片随机选取3个视野（n=6）观察大鼠脑组织形态结构变化。

1.8 免疫组化法观察大鼠脑组织Nestin、GFAP阳性表达

石蜡切片常规脱蜡、水化后放于柠檬酸钠溶液中2.5 min进行抗原修复，滴加阻断液浸泡15 min，5%BSA溶液中封闭20 min，4 ℃过夜孵育一抗（Nestin 1∶500、GFAP 1∶500），滴加100 μL反应增强液、孵育二抗（PE 1∶500），每次孵育前后PBS溶液清洗切片。避光条件下滴加100 μL DAPI染色剂，显微镜下观察到显色充分后终止显色，蒸馏水洗涤后进行苏木素染色，脱水干燥后中性树胶封片，在400倍视野下同一矢面切片随机选取3个视野（n=6），Image J软件分析目标蛋白平均光密度值（AOD）。

1.9 免疫荧光法观察大鼠脑组织梗塞侧Nestin/BrdU、GFAP/BrdU双标记表达

石蜡切片常规脱蜡、水化、抗原修复后于5%BSA溶液中封闭20 min，4 ℃过夜孵育一抗混合液（Nestin/BrdU 1∶500、GFAP/BrdU 1∶500），避光孵育二抗（PE 1∶500）1.5 h，每次孵育前后磷酸缓冲盐溶液（PBS）溶液清洗切片，100 μL DAPI染色剂避光显色10 min，晾干后抗荧光衰减封片剂封片，在400倍视野下同一矢面切片随机选取3个视野（n=6），采用激光共聚焦技术观察目标蛋白双标记分布，Image J软件对荧光图片拟合。

1.10 统计学方法

所有数据采用SPSS26.0软件分析。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，方差不齐采用Dunnett’s T3法。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠一般情况及行为学比较

空白组及假手术组大鼠各项生命体征正常，无神经功能缺损。模型组、电针组大鼠模型制备后可见感觉：左侧视力及左前肢推爪收缩反应减弱。运动：提起鼠尾时左前肢屈曲、头偏离中轴，行走时朝左侧旋转。反射：肢、角膜反射减弱。平衡：直杠平衡测试于1 min内掉下平衡木。随干预时间的增加，两组大鼠感觉及反射活动逐渐增强，左前肢屈曲、行动左旋幅度降低、于平衡木上时间增长，但电针组优于模型组。与空白组、假手术组比较，模型、电针组各时相NSS评分均明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，电针组3、7、14 d时NSS评分均降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。

2.2 各组大鼠脑组织病理形态比较-HE染色

光镜下HE染色，细胞核为蓝色深染，细胞质为粉红色淡染。空白、假手术组大鼠脑组织细胞核多为圆形，核仁清晰、细胞完整饱满。1 d时，模型组与电针组均可见大量细胞空泡、细胞缩小、胞质减少、核固缩等；3、7、14 d两组细胞空泡逐渐减少、胞质增加，核固缩情况好转，均可见新生的结缔组织填充，且电针组较模型组可观察到更多结构正常细胞，胶质纤维填充丰富，整体修复情况优于后者。见图 1。

2.3 各组大鼠脑组织Nestin水平比较

免疫组化检测显示大鼠脑组织Nestin阳性表达呈褐色。空白、假手术组大鼠脑组织胞质见Nestin极少量浅淡阳性表达。1、3、7 d时，模型组与电针组Nestin表达逐渐增加，染色深度加深，14 d时，两组Nestin表达减少。与空白组和假手术组比较，模型组大鼠各时相Nestin AOD均明显升高（P < 0.01），7 d时达峰值；与模型组比较，电针组大鼠各时相Nestin AOD均较高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表 2、图 2。

2.4 各组大鼠脑组织GFAP水平比较

免疫组化检测示GFAP阳性表达呈褐色。空白、假手术组大鼠脑组织见GFAP少量阳性表达。1、3、7、14 d时，模型、电针组阳性细胞数量逐渐增多、染色深、阳性面积增大。与空白、假手术组比较，模型组大鼠各时相GFAP AOD均明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，电针组大鼠3、7、14 d时损伤脑组织GFAP AOD均升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表 3、图 3。

2.5 各组大鼠脑组织Nestin/BrdU、GFAP/BrdU荧光双标记水平比较

免疫荧光法检测示细胞核为蓝色荧光，BrdU为红色荧光，Nestin及GFAP为绿色荧光，同一视野图片拟合后，橙、黄色重合部分为共同标记处。空白、假手术组仅可见少量阳性细胞荧光表达。Nestin/BrdU双标记显示中，1、3、7 d电针组与模型组均可见荧光共表达，呈增长趋势；14 d时，两组荧光共表达减少。与空白、假手术相比，模型组Nestin、BrdU荧光信号强，共表达突出；与模型组相比，电针组共表达量较多。GFAP/BrdU双标记显示中，1、3、7、14 d电针组与模型组均可见荧光共表达，且呈增长趋势。与空白、假手术相比，模型组GFAP、BrdU荧光显示较为集中，共表达信号强；与模型组相比，电针组3、7、14 d BrdU荧光较明显，共表达面积较大。见图 4、图 5。

3 讨论

CI属中医“中风”范畴，其病位在脑，因风、火、痰、气、瘀、虚6种病理因素相互转化或合而为病，西医发现CI发生后，脑组织缺血、缺氧致使大量神经元损伤、坏死，而出现相应神经功能缺损的症状^[7]。本院采用针刺治疗CI已有30余年的历史，指出CI的关键病机是“窍闭神匿，神不导气”，创立的醒脑开窍针法在改善CI后神经功能、吞咽障碍、语言障碍等方面获得良好的临床疗效。人中穴为醒脑开窍针法中主穴、也是中风病治疗的常见穴，首载于《针灸甲乙经·面凡二十九穴第十》，又名水沟穴，位于人中沟上1/3与下2/3的交点处，属督脉腧穴^[8]，具有醒神开窍、疏通经络、解痉通脉、镇静安神等效用。中风急性期治疗以醒神为主，针刺人中可发挥调督脉阳气、醒脑神、开清窍的作用；而在中风恢复期则以调神为主，此期针刺人中的作用在于调节聚积之神气，使之输布于肢体及咽喉舌窍，发挥脑神主运动、主感觉等作用^[9]。现代研究亦发现针刺人中穴能抑制细胞凋亡、减轻炎症反应、抑制氧化应激，缓解缺血后血管平滑肌痉挛，增加代偿血流促进血管新生，建立有效侧支循环以重建血管神经单元，从而增加缺血半暗带和梗死区的脑血流供应，减轻CI神经元损伤，发挥脑保护作用^[10]。课题组前期一直从事CI发生后脑血管机能状态的研究，前期成果证实针刺人中穴可有效改善MCAO模型大鼠脑微循环流质、流场及其节律运动功能，尽早恢复缺血区血供，缩小梗死面积^[11]的确切作用，故未再设西药阳性对照组。

本实验为动态观察CI后eNSPCs表达变化规律，根据病理分期拟定了4个观测时相。1 d是CI急性期和坏死期的临界点，细胞在形态学上出现改变，3 d开始缺血区脑组织进入软化期，脑组织形态改变明显。在CI后血管新生的研究中发现，缺血边界区在缺血后6~24 h即出现内皮细胞增殖，3 d时可观察到梗死灶周围微血管密度增加^[12]，缺氧导致的血管生长因子的高表达状态多在缺血后7 d恢复到正常水平。神经再生与血管生成的关系密切，血管为神经生长提供了良好的微环境，因此，为综合观察CI后脑组织神经新生变化，研究选取了1、3、7、14 d时相来进行动态观察。电针的参数在起效机制和治疗效果方面差异较大，主要涉及刺激频率、刺激强度、波形和刺激时间。10 Hz以上的电刺激可选择性使血管活性肠肽等肽能神经递质释放^[13]，且有研究表明，高频率的电针刺激对卒中患者的治疗作用明显优于低频率者，但50 Hz时使受试者感到不适，故常选用15 Hz作为卒中治疗频率^[14]。研究表明中强度（2~4 mA、20 Hz/4 Hz）电针在调节正常大鼠脑组织海马CA1区、齿状回及皮质区磷酸化蛋白激酶B阳性细胞的表达，比高强度电针更有效^[15]。且连续波能促进血液、淋巴循环以及离子的运转，并且不会因刺激过强而引起疼痛，避免机体组织产生抵御性反应^[16]。基于数据发掘对电针治疗脑卒中文献进行归纳分析^[17]，15 Hz的连续波在脑卒中的治疗中的运用频次较高。故而，选用15 Hz、中强度、20 min的连续波作为电针治疗参数。

神经干细胞是一类来源于神经系统或能生成神经组织的细胞群，具有自我更新和分化的基本特征，可分化产生神经元、星形胶质细胞（Ast）和少突胶质细胞。正常情况下^[18]，大脑中的神经干细胞多处于休眠状态，脑缺血可刺激其增值，且缺血后大脑缺血区微环境稳态发生变化，从而影响eNSPCs增殖、迁移、分化及成熟。BrdU是一种DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，常用于标记增殖细胞，其阳性细胞的数目基本可代表脑内神经前体细胞的发生水平。GFAP和Nestin是鉴定神经干细胞特异性分化的标志物。Nestin是一种细胞骨架蛋白，胚胎期到成年期在中枢神经系统的神经干细胞和神经祖细胞中表达，能被BrdU掺入标记反映细胞增殖状态^[19]，当神经前体细胞分化为神经元、胶质细胞时Nestin表达下降，因此Nestin被广泛用作识别神经干细胞分化的标记物。GFAP是Ast中主要的单体中间丝蛋白，是中枢神经系统所独有的特异性细胞骨架蛋白^[20]，为Ast的标记性蛋白，通常用于检测Ast的增殖分化。eNSPCs具有分化潜能和自我更新的特性是神经再生修复的物质基础。由神经干细胞相邻的支持细胞、细胞因子、细胞外基质和微血管网等组成的神经干细胞微环境，是eNSPCs增殖分化等行为高度依赖的生长环境，与神经再生修复密切相关^[21]。Ast具有调节细胞代谢和保持周围环境稳定的作用，且能通过合成和分泌各种信号因子调节神经元的生存，控制突触的形成、成熟及修剪^[22]，因而在脑内微环境中影响神经干细胞的增殖和分化，同时调控突触整合和新生神经元的功能成熟，而影响脑组织神经网络重建^[23]。

研究结果显示，血管分离等操作对神经细胞的增殖、分化无影响。脑缺血后大鼠神经功能缺损，各时相模型组的Nestin、GFAP表达量均明显高于假手术组，3~14 d电针组NSS评分低于模型组，说明脑缺血发生后刺激eNSPCs增殖、分化，电针干预能促进大鼠神经功能恢复，减轻肢体活动不利的状态。1~7 d时，电针组Nestin表达高于模型组，且Nestin/Brdu双标记信号强，这与罗丁等^[24]针刺人中穴的研究结果一致，表明针刺人中穴能促进MCAO大鼠神经干细胞的增殖。电针及模型组Nestin在第7 d达峰值后表达降低，表明脑组织eNSPCs增殖在梗死前期较为明显；3~14 d时电针组GFAP表达高于模型组，这与李钦潘等^[25]研究结果相符，表明针刺人中穴能促进eNSPCs分化为Ast，但与张亚贵等^[26]运用2 Hz电针针刺百会和大椎穴的研究结果有差异，其结果发现电针组在7 d、14 d时GFAP表达低于模型组，认为电针通过抑制Ast的过度活化和增殖状态来发挥脑保护作用。分析GFAP表达差异可能与穴位和频率的不同相关，研究表明，低频电刺激对于周围神经系统损伤的修复效果较佳，15 Hz电针治疗可通过上调大脑缺血区域Ast的表达促进大鼠神经功能恢复^[27]，电针百会穴、人中穴^[28]均可改善MCAO大鼠神经功能，减轻神经元损伤，但具体作用机制尚不完全明确，因而，微观上GFAP表达趋势的差异与宏观上相同的促神经功能恢复作用之间，是否与针刺双向调节机制有关，值得进一步探讨。

综上所述，研究结果表明，电针人中穴干预可改善大鼠神经功能状态，调控eNSPCs的增殖并分化为Ast，以促进神经干细胞微环境稳态的恢复，重建功能神经网络的作用。然而，电针介入后Ast所介导的作用机制尚不完全明确，且eNSPCs的分化、迁移涉及多个脑组织区域，为清晰完善地描述电针人中穴对eNSPCs产生的作用，未来将在该实验基础上进一步探索海马齿状回颗粒细胞下区、侧脑室室下区及嗅球特定区域新生细胞的动态迁移变化规律以及Ast介导的细胞因子保护机制。