疏血通注射液由水蛭和地龙两种中药提取制备而成，具有活血化瘀，通经活络的功效^[1]。水蛭性平，味苦、咸，具有破血通经，逐淤消癥的功效。地龙性寒，味咸，可清热定惊，通络，平喘，利尿^[2]。两者相须使用能增强活血化瘀之功，临床常用于治疗中风类疾病^[3]。疏血通注射液疗效确切，现代药理研究表明其具有溶栓、扩张血管、改善血液流变学、抑制血小板聚集、调节血脂、保护神经细胞等药理作用^[4-7]，临床被广泛应用于治疗缺血性脑血管疾病、慢性肾功能衰竭、高血脂症、糖尿病及其并发症^[8-11]。

疏血通注射液的化学成分复杂，其药效物质基础尚不明确。有关疏血通注射液的研究主要集中在药理方面，而对其成分及含量测定的研究报道较少，目前仅报道过氨基酸及多肽类^[12-13]、短链脂肪酸^[14]、微量元素^[15]和糖类^[16]的含量测定，疏血通注射液的质量评价指标尚不完善。核苷类成分是动物类中药发挥药效的主要成分之一，也是鉴别地龙真伪的重要依据。次黄嘌呤作为地龙的主要药效成分之一，易于透过细胞膜，能够参与体内多种代谢过程，调节多种生物酶的活性^[17]。以次黄嘌呤为代表的核苷类成分具有抗菌、抗病毒、调节免疫等作用^[18]。有学者以次黄嘌呤为检测指标，单独对其进行测定研究^[19-20]，然而仅以次黄嘌呤作为疏血通注射液的质量评价指标，难以全面评价其质量现状。

中药指纹图谱作为一种可靠的中药质量评价模式，能够综合性地评价中药成方制剂质量的真实性和一致性，监控成品批间质量的稳定性^[21]。近年来，中药指纹图谱结合多成分含量测定的方法逐渐应用于中药成方制剂的质量评价^[22]。疏血通注射液中的核苷类化合物作为其主要活性成分之一，对人体的免疫系统、神经系统、心血管系统均发挥着重要作用^[23-24]。因此，本研究建立了33批疏血通注射的超高液相色谱（UPLC）指纹图谱，同时对其中的尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟嘌呤核苷进行含量测定，以期为疏血通注射液的质量评价提供参考。

1 仪器、试剂与药物 1.1 仪器

Waters Acquity超高效液相色谱仪（美国Waters公司），配有在线脱气机、二元泵、恒温自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器（PAD）；AX 205型十万分之一天平（瑞士MettlerToledo公司）；Milli-Q超纯水制备仪（Millipore公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 试剂与药物

尿嘧啶（批号：T14A8X33880）、次黄嘌呤（批号：TM0313XC13）、黄嘌呤（批号：AJ0722MA14）、肌苷（批号：TM0313XA13）、鸟嘌呤核苷（批号：KM0522CA14）均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%；33个批次的疏血通注射液（编号S1~S33）均购自牡丹江友搏药业有限责任公司，具体信息见表 1。乙腈（色谱纯）购自美国Fisher公司；甲酸（色谱纯）购自美国ROE公司；超纯水为实验室自制。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A相为0.1%甲酸水，B相为乙腈；梯度洗脱，洗脱梯度：0~1 min，97%~86% B；1~8 min，86%~65% B；8~9 min，65%~97% B；流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：1 μL；检测波长：254 nm。

2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取尿嘧啶、次黄嘌呤对照品2.0 mg，取10 mL容量瓶，用超纯水定容至10 mL，配制成分别含尿嘧啶、次黄嘌呤200 μg/mL的储备液；分别精密称取黄嘌呤、鸟嘌呤核苷对照品1.0 mg，加超纯水定容至10 mL，配制成分别含黄嘌呤、鸟嘌呤核苷100 μg/mL的储备液；精密称取肌苷对照品5.0 mg，加超纯水定容至5 mL，配制成含肌苷1 mg/mL的储备液，4 ℃冰箱储存备用。

2.2.2 样品溶液的制备

精密吸取不同批次疏血通注射液（S1~S33）各1 mL，用超纯水稀释5倍，4 ℃冰箱储存备用。

2.3 指纹图谱研究 2.3.1 精密度实验

精密吸取100 μL“2.2.2”项下制备的疏血通供试品溶液（S16），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次。各色谱峰峰面积的RSD值在0.48%~4.03%，相对保留时间的RSD值在0.01%~0.08%，表明该方法精密度较好，具体结果见表 2。

2.3.2 重复性实验

取疏血通注射液（S16）按“2.2.2”项下方法制备6份，分别按“2.1”项下色谱条件进样，各色谱峰峰面积的RSD值在0.23%~4.24%，相对保留时间的RSD值在0.01%~0.07%，表明该方法重复性较好，具体结果见表 2。

2.3.3 稳定性实验

精密吸取100 μL“2.2.2”项下制备的供试品溶液（S16），分别在室温下放置0、2、4、6、8、12 h后，按“2.1”项下色谱条件进样，各色谱峰峰面积的RSD值在0.65%~5.29%，相对保留时间的RSD值在0.01%~0.21%，表明样品室温放置12 h稳定，具体结果见表 2。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度分析

分别精密吸取“2.2.2”项下制备的33批供试品溶液（S1~S33）各100 μL，按照“2.1”项色谱条件分别测定，得到不同批次的疏血通注射液UPLC图谱。使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2.0版，国家药典委员会，2010），以S1为参照色谱图，对33批疏血通注射液的实验数据进行分析，得到33个不同批次的疏血通注射液指纹图谱和对照指纹图谱R，见图 1。共标定出10个共有峰，以对照图谱R为参考，33批疏血通注射液相似度均高于0.998，具体结果见表 3。

2.3.5 共有峰指认

精密取100 μL“2.2.2”项下制备的供试品溶液（S16）、对照品溶液及供试品溶液按照“2.1”项色谱条件分别测定，记录UPLC色谱图，见图 2。次黄嘌呤作为参照峰，以色谱峰保留时间为依据，通过与对照品比对指认出5个已知峰，分别为尿嘧啶（1号峰）、次黄嘌呤（2号峰）、黄嘌呤（3号峰）、肌苷（4号峰）、鸟嘌呤核苷（7号峰）。

2.4 含量测定 2.4.1 线性关系、检测限和定量限考察

取各对照品储备液适量，用超纯水配制成含尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷、鸟嘌呤核苷25 μg/mL；含次黄嘌呤50 μg/mL的混合对照品溶液，将此溶液用超纯水依次稀释2.5、2、2、2.5、2倍，得6个浓度的对照品混合溶液。取各浓度的上述溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样分析。以各对照品峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度（X）为横坐标，得到尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟嘌呤核苷的回归方程。将该混合对照品溶液逐步稀释，分别以S/N≥3和S/N≥10时各对照品的浓度作为最低检测限（LLOD）和最低定量限（LLOQ）。结果见表 4。

2.4.2 精密度实验

精密吸取100 μL“2.2.2”项下制备的供试品溶液（S16），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次。记录5种成分峰面积，计算得尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷和鸟嘌呤核苷的RSD值分别为2.2%、1.9%、2.4%、2.3%、2.4%，表明该方法日内精密度较好。

精密吸取100 μL“2.2.2”项下制备的供试品溶液（S16），按“2.1”项下色谱条件重复进样2次，连续进样3 d。记录5种成分峰面积，计算得尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷和鸟嘌呤核苷的RSD值分别为1.5%、1.7%、3.2%、1.5%、3.7%，表明该方法日间精密度良好。

2.4.3 重复性实验

取疏血通注射液（S16）按“2.2.2”项下方法制备6份，分别按“2.1”项下色谱条件进样。记录5种化合物的含量，计算得尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷和鸟嘌呤核苷的RSD值分别为0.6%、0.6%、0.9%、1.7%、3.0%，表明该方法重复性较好。

2.4.4 稳定性实验

精密吸取100 μL“2.2.2”项下制备的供试品溶液（S16），分别在室温下放置0、2、4、6、8、12 h后，按“2.1”项下色谱条件进样，记录5种成分色谱峰峰面积，计算得尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷和鸟嘌呤核苷的RSD值分别为1.1%、1.9%、2.6%、1.5%、2.4%，结果表明样品室温放置12 h稳定。

2.4.5 加样回收率实验

取已知含量的疏血通注射液6份（S16），加入一定量混合对照品溶液涡旋混合完全，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算得尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷和鸟嘌呤核苷的加样回收率分别为99.9%、100.0%、108.4%、95.1%、104.6%，RSD值分别为0.9%、0.9%、1.3%、1.1%、1.7%，具体结果见表 5。

2.5 样品测定

分别精密吸取“2.2.2”项下制备的33批供试品溶液（S1~S33）各100 μL，并根据已建立的色谱分析方法进行测定，计算得不同批次中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟嘌呤核苷5种核苷类成分的平均含量分别为34.57、153.50、52.76、53.23、14.46 μg/mL，测定结果见图 3。

3 讨论

疏血通注射液中化学成分复杂，主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、酶类、酯类、核苷酸类、金属微量元素等。核苷类成分是人体代谢必不可少的成分，也是动物类中药发挥功效的主要成分。其由碱基和核糖两部分组成，碱基主要包括腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶等，而次黄嘌呤、黄嘌呤是腺嘌呤、鸟嘌呤的中间体。核苷类成分不仅是组成DNA、RNA单体的前体，也是生物氧化及代谢过程中的能源物质，并参与调节生物体内多种生理代谢过程^[25]。核苷类成分具有多种生物学活性^[26]，如肌苷能够调节人体免疫功能，保护肝细胞^[27]；鸟苷通过增强巨噬细胞的释放来调节免疫功能^[28]；尿苷可以调节体温以及控制能量平衡^[29]。因此，核苷类成分可以作为疏血通注射液质量评价指标之一。

本研究建立了33批疏血通注射液UPLC指纹图谱，相似度分析结果显示，其与对照图谱R的相似度均在0.998以上，提示33批疏血通注射液的化学成分基本一致。33批样品共标定了10个共有峰，其中有5个已知峰，分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟嘌呤核苷。同时建立了此5种核苷类成分含量测定的方法。结果表明，33个批次中各化合物含量差异不大，疏血通注射液的制备工艺相对稳定。五个化合物中次黄嘌呤平均含量最高，为153.50 μg/mL；鸟嘌呤核苷平均含量最低，为14.46 μg/mL；尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷平均含量分别为34.57、52.76、53.23 μg/mL。

综上所述，本实验建立了疏血通注射液UPLC指纹图谱和5种核苷类成分的定量方法。此方法稳定可靠、操作简便，可以为疏血通注射液的质量评价提供参考。