高血压病为中国最常见的成人疾病之一，最新研究显示，中国成年居民高血压病患病率为27.9%且患病率逐步上升，而其控制率却仅为16.8%^[1]。高血压病的并发症如冠心病为中国成年居民的主要死亡原因^[2]，同时血压升高常会导致血液供应器官和/或动脉血管系统，如心脏、大脑、肾脏、眼等的损害，进而影响患者生存质量^[3-4]。

传统医学无高血压病之病名，其归属于“眩晕”“头痛”等范畴^[5]。对于其治法，历代医家多从肝论治，临床案例丰富且疗效确切^[6-7]；且中医药联合西药较单一西药降压效果更好，中医药治疗高血压病经济负担小、不良反应少、低耐药性等优势突出，因此成为多数国人补充与替代治疗的选择^[8]。夏桑菊颗粒原料为夏枯草、桑叶、野菊花，收录于《中华人民共和国卫生部药品标准》，2020版《中国药典》记载其可清肝明目，疏风散热，用于高血压病、头晕耳鸣、风热感冒等疾病^[9-10]；且其原料安全，药食两用，以槲皮素、山奈酚、木犀草素等黄酮类为主的成分具有明显的心血管保护活性，具备一定的心血管疾病保健、预防、医疗潜力^[11]。但目前对于夏桑菊颗粒降压的临床及作用机制研究尚有不足，没有充分发挥药典对临床用药的指导作用。

随着分子生物学的发展，微阵列芯片如基因芯片等技术逐渐成熟，为基因研究提供了大量高通量数据^[12]。基因表达汇编（GEO）数据库是一个存储芯片及其他高通量测数据的一个数据库，为基因研究提供平台，也为实验前期研究准备工作提供条件^[13]。本研究通过GEO芯片并结合其他数据库挖掘技术，联合网络药理学及分子对接的方法，探讨夏桑菊颗粒治疗高血压病的活性成分、靶点及通路，以期对后续的科研及临床应用提供一定的借鉴。

1 资料与方法 1.1 活性成分及成分靶点的筛选

将夏枯草、桑叶、野菊花逐次输入到TCMSP数据库（https://tcmsp-e.com/），选定口服生物利用度（OB）及类药性（DL）为筛选指标，其中OB是指活性成分实际进入循环的百分比，DL是指活性成分与已知药物的相似性。本研究设置OB≥30%，DL≥0.18，搜索筛选夏枯草、桑叶、野菊花的活性成分及对应靶点，合并后去重。将夏桑菊颗粒的活性成分及成分靶点导入至Cytoscape软件，构建“中药-化合物-靶点”网络，将活性成分与交集靶点的对应可视化；并根据网络中节点的degree值获得网络中前10位的成分靶点及疾病靶点。

1.2 疾病靶点及成分-疾病交集靶点的获取

在GEO数据库以“Hypertension”为关键词、物种为人类进行检索，获取相关基因矩阵数据文件，设置筛选标准（P＜0.05，|Log2^{fold change}|＞0.5）筛选差异基因即本数据集中与高血压病相关的疾病基因，并利用GEO2R工具绘制火山图。以“Hypertension”为关键词，在Genecards数据库（https://www.genecards.org）、OMIM数据库（http://www.omim.org）、TTD数据库（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）3个数据库中搜索高血压病相关基因，其中Genecards数据库搜索后通过相关性得分≥均值进行筛选。将GEO芯片所得差异基因与3个数据库所得基因合并后去重，即为高血压病疾病靶点。将成分靶点及疾病靶点导入UniProt数据库标准化后，筛选交集靶点，即为夏桑菊颗粒治疗高血压病的潜在作用靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及关键靶点筛选

将交集靶点导入STRING数据库，设置置信度≥0.9，绘制蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，计算网络拓扑属性结果并输出为TSV格式导入Cytoscape，计算节点自由度，并筛选度中心性、接近中心性及中间性中心性均在网络中所有靶点均值之上的靶点作为关键靶点，并在后续研究中对其进行分子对接模拟验证。

1.4 基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

通过Metascape平台对交集靶点进行GO及KEGG富集分析（P＜0.01，FDR＜0.05），其中GO分析包括生物学过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）分析。将结果输出为柱状图及气泡图。

1.5 分子对接验证

关键靶点中，按照度中心性排名获得前4位靶点，通过PDB数据库获得其结构并预处理；通过PubChem数据库获得靶点对应活性成分的结构并预处理，使用Vina软件进行两者间分子对接并计算结合能，将结合能最小的前6位的结果可视化，绘制靶点与活性成分间连接方式。

2 结果 2.1 夏桑菊颗粒活性成分及成分靶点的筛选

根据OB≥30%，DL≥0.18标准，搜索筛选后共得到夏桑菊颗粒活性成分52种，其中夏枯草活性成分11种，桑叶活性成分29种，野菊花活性成分12种。活性成分对应靶点963个，去重后得到成分靶点194个。构建的“中药-化合物-靶点”网络中，B1（槲皮素）和B2（β-谷甾醇）为3种中药共有；A1（木犀草素）为夏枯草和野菊花共有，A2（山柰酚）及A3（豆甾醇）为夏枯草和桑叶共有，见图 1。边表示节点之间的联系，常用自由度来表示，自由度越高则节点在网络图中的作用越大。网络中自由度排名最高的药物为桑叶，成分如槲皮素、木犀草素及山奈酚，靶点如PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AA1，见表 1。

2.2 疾病靶点及交集靶点的获取

GEO筛选数据集中，选择GSE24752作为研究数据集，该数据集包含3例原发性高血压病患者及3例健康志愿者，利用GEO2R工具筛选、整理后得差异基因329个，其中上调基因213个，下调基因116个，见图 2。从GeneCards数据库检索得高血压病相关基因8 968个，根据均值筛选后得基因1 855个；检索OMIM数据库及TTD数据库，分别得到46个基因和68个基因。将GEO差异基因与3个数据库基因合并后去重，共得到高血压病疾病靶点2 168个，其中有291个靶点仅来源于GEO差异基因。将2 168个疾病靶点与194个治疗靶点取交集，共得到交集靶点126个，其中有8个靶点来源于GEO差异基因。

2.3 PPI网络及关键靶点

将126个交集基因导入String网站，将数据以TSV格式保存后导入至Cytoscape构建PPI网络图，见图 3。节点计算自由度后按颜色显示，颜色越深代表节点自由度越高；第一次筛选后得靶点18个，两次筛选后得到关键靶点共6个：JUN、MAPK1、AKT1、TP53、HSP90AA1、CTNNB1。

2.4 GO富集分析与KEGG富集分析

GO及KEGG富集分析见图 4、图 5。图 5气泡图中气泡的大小代表富集靶点多少，颜色由红到绿代表显著性由高到低。结果显示GO生物过程主要涉及对激素、无机物、氮化合物、脂多糖、细胞外刺激等的反应；细胞组分主要涉及膜筏、膜微区、小窝、质膜筏、膜侧等；分子功能涉及DNA结合转录因子结合、转录协同调节因子结合、转录因子结合、磷酸酶结合等。KEGG富集分析包括与高血压病关系密切的通路如脂质与动脉粥样硬化、晚期糖基化产物-晚期糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）、磷酸酰肌醇3-激酶-丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、肿瘤坏死因子（TNF）等信号通路。表明夏桑菊颗粒的有效成分可能作用于这些通路起到降压作用，见图 6。

2.5 分子对接结果

用AutoDockTools软件对关键靶点JUN、MAPK1、AKT1、TP53与其在“中药-化合物-靶点”网络图中对应的活性化合物进行分子对接，结果见表 2。其中，结合能代表预测结合的强度，结合能越小，代表对接越牢固，其数值小于-5.0 kcal/mol时代表结合较好，小于-7.0 kcal/mol代表结合强烈^[14]。本研究显示预测结合能均小于-5 kJ/mol，代表结合的可能性较好。将结合能最小的6组对接结果可视化，显示JUN可通过ASP-464与山奈酚形成氢键结合，可通过JLN-571、HIS-420、LYS-434与木犀草素形成氢键结合，可通过VAL-580、GLN-669、PRO-578与槲皮素形成氢键结合；MAPK1可通过ALA-52、LYS-54与槲皮素形成氢键结合，可通过ALA52、LYS54、LYS114与木犀草素形成氢键结合。见图 7。

3 讨论

对于高血压病之中医治疗，历代医家多从肝论治，夏枯草、桑叶、菊花更为其中之常用药，临床上常组合使用。如俞式羚角钩藤汤中便有“桑叶，菊花”组合；黄明艳等^[15]对国医大师陈可冀治疗高血压病的经验进行总结，临床常用“夏枯草，桑叶，菊花”之组合清肝泻火；陈婷等^[16]对360首治疗高血压病中药复方数据挖掘后，发现频数最多的药物组合为“夏枯草，野菊花”。关于3味中药治疗高血压病的基础研究亦十分丰富，如研究发现，野菊花提取物可增强血管紧张素转换酶2表达，降低丙二醛含量，增强超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶的活性等起到降压作用^[17]；野菊花中成分蒙花苷可通过抑制血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）/血管紧张素受体1型信号通路的活化，从而起到抗高血压病血管重构的作用^[18]。研究发现，夏枯草提取物亦能有效降低自发性高血压病大鼠的血压及降低血清AngII浓度^[19]。且3味中药来源安全，药食两用，以此为原料的夏桑菊制剂如夏桑菊颗粒/片/凉茶等药用或保健产品市场应用相当广泛。

传统中医药以宏观、综合、整体的角度治疗高血压病疗效确切，但也一定程度上存在微观及量化上的不足。网络药理学可从微观角度进行药物研究^[20-21]，可揭示中药及中药复方协同作用于人体的机制研究，为中医药的发展提供了新方向，可以很好地揭示夏桑菊颗粒降压的微观内涵。传统的网络药理学技术多通过OMIM等数据库获得疾病靶点^[22]，生物信息学如GEO芯片技术可为基因研究提供大量数据，扩大了疾病靶点数据来源；且较以往数据库相比，挖掘GEO数据库可定性定量得出疾病患者基因较正常人的表达差异，使数据准备更充分。但单纯的GEO芯片技术又受数据集样本限制^[12]。故本研究通过GEO芯片结合其他数据库挖掘技术，一定程度上完善了疾病靶点数据库。

研究得到夏桑菊颗粒中52种化合物成分，“中药-化合物-靶点”网络中，发挥降压作用最活跃的成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇。其中槲皮素、木犀草素及山奈酚均为黄酮类，而黄酮类化合物普遍可通过调节内皮素合成及钙离子通道、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、促进一氧化氮（NO）生成等多种途径发挥降压作用^[23]；β-谷甾醇可降血脂、抗炎、降低血清总胆固醇水平，从而降低高血压病及其相关的心血管病风险^[24]；豆甾醇具有抗低密度脂蛋白氧化和抗血小板聚集作用，具有保护心血管的活性^[25]。由此可见，夏桑菊颗粒中的活跃成分如槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等黄酮类或甾醇类成分，可以起到很好的心血管保护活性。

PPI网络及关键靶点分析显示，夏桑菊颗粒可通过JUN、MAPK1、AKT1、TP53、HSP90AA1、CTNNB1等关键靶点起到降压作用，同时该6个靶点与高血压病密切相关。复合物激活蛋白1，其组成部分c-JUN可参与调控细胞增殖、分化及凋亡，同时其低表达时，也会抑制线粒体融合蛋白2的表达，从而促进异常的血管平滑肌细胞增殖引起高血压病、动脉粥样硬化等多种心血管疾病^[26]；MAPK在各种肥大细胞刺激因子胞内外信号传导中发挥重要作用^[27]，其家族成员如p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶等与细胞的生长、分裂、死亡等密切相关，介导心肌细胞反应、心肌肥大及心肌纤维化等，从而间接影响高血压病发生发展^[28]。AKT1基因突变能够大大增加罹患高血压病的风险，同时AKT1信号通路的受损会导致胰岛素不能有效传递给血管系统中的内皮一氧化氮合酶，进而会导致肥胖和其他胰岛素抵抗状态下的动脉功能障碍和高血压病^[29-30]。HSP90在肺动脉高压患者肺动脉平滑肌细胞线粒体中的增殖，从而促进血管重塑^[31]。CTNNB1基因突变是原发性醛固酮增多症的危险因素，而后者常引起继发性高血压病^[32]。

交集靶点的GO富集分析显示，夏桑菊颗粒活性成分可调节细胞反应、运动及凋亡等生物过程；KEGG通路富集结果表明，其绝大部分基因富集在脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE、PI3K-AKT、MAPK、TNF等信号通路。AGEs可在高血糖、氧化应激等环境下迅速聚集，并通过与其特异性受体结合，增加炎性细胞因子的释放及激活核因子κB炎症信号通路等，改变动脉顺应性从而导致原发性高血压病的发生^[33]。PI3K-AKT信号通路为经典的传导通路，参与细胞全生命周期及调控蛋白合成、血管生成等重要生理过程^[34]，其可通过保护血管内皮功能、调控血管平滑肌、维持心脏代偿功能等发挥防治高血压病作用^[35-37]。TNF为细胞因子中的重要一员，其与高血压病的关系也十分密切。TNF有TNF-α与TNF-β两种，其中TNF-α-308G/A基因多态性与原发性高血压病关系密切^[38]。TNF-α可通过损伤血管内皮、促进局部血管平滑肌细胞活化与增殖、促进白介素等炎症分子释放等过程，促进高血压病的发生发展^[39]。

分子对接结果显示结合能均小于-5.0 kcal/mol，提示对接结果较理想，一定程度上说明本研究的可行性。结合能最小的前6位活性成分同样为槲皮素、β谷甾醇等成分，提示夏桑菊颗粒可能主要依靠黄酮类、甾醇类等发挥降压作用，可通过后续进一步的实验研究来深入探讨。

本研究通过网络药理学及分子对接等技术，探讨夏桑菊颗粒降压的潜在机制。但本研究依然存在不足之处，如活性成分等均来源于单味中药与实际依然可能存在差距、受数据集本身的限制GEO芯片所得差异基因在交集靶点中占比略低等。同时，本研究为后续的实验及临床研究提供了一定参考，还需通过基础实验进一步开展机制验证。