2023, Vol. 40文章信息
- 张杰, 刘小溪, 张雪竹.
- ZHANG Jie, LIU Xiaoxi, ZHANG Xuezhu.
- 针刺调控miR-10a改善VD大鼠认知并减轻神经炎症的研究
- Study on acupuncture regulating miR-10a to improve cognition and reduce neuroinflammation in VD rats
- 天津中医药, 2023, 40(4): 467-473
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2023, 40(4): 467-473
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2023.04.11
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文章历史
- 收稿日期: 2023-01-25
2. 国家中医针灸临床医学研究中心, 天津 300381
血管性痴呆（VD）临床发病率较高，严重影响患者的生活质量并增加照料者的负担，但若能早期干预可显著延缓患者的认知退行速度。因此探索其发病机制、寻求有效治疗措施是当务之急。
脑缺血是VD发生的最主要原因，缺血导致的炎症反应贯穿VD发生、发展的全过程。动脉粥样硬化是一种慢性低级别的炎症性疾病，同时也是冠心病及缺血性脑血管病发生的主要原因。近年来发现Micro RNA 10a（miR-10a）在机体炎症应答过程中有重要作用，并与动脉粥样硬化、冠心病的潜在炎症机制存在一定相关性。研究发现，miR-10a可以抑制血管内皮细胞的炎症反应，进而参与调节动脉粥样硬化等的病理过程[1]。冠心病患者粥样斑块中miR-10a表达下调，且其水平与促炎因子白介素（IL）-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度呈负相关，与抗炎因子IL-10浓度呈正相关[2]。最新研究显示，miR-10a与缺血性卒中易感性和卒中后病死率相关[3]。
鉴于miR-10a参与调控动脉粥样硬化斑块内的炎症反应，且动脉粥样硬化是脑缺血的主要诱发因素，因此推测miR-10a很可能参与了VD脑内神经炎症的调节，但目前尚缺乏相关报道。
针刺是治疗VD的有效手段，课题组前期采用针刺治疗VD取得较好疗效，能明显改善患者的认知功能及日常生活能力[4]；同时也证明针刺还具有降低缺血后脑组织神经炎症反应、抗氧化、抗凋亡等作用[5]。但目前关于针刺降低神经炎症反应的研究多从降低炎症因子表达的角度进行，对micro RNA的关注较少，因此文章即从miR-10a的角度阐释针刺改善VD认知并调控神经炎症的可能机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器Trizol、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan MicroRNA Assay购自Thermo Fisher Scientific公司；Lipofectane 2000购自Qiagen公司；引物由上海生工生物有限公司合成。兔源核因子-κB（NF-κB）p65多抗、NF-kB p65（磷酸化位点S536）单抗、兔源β-actin单抗购自Abcam公司；RIPA裂解液、BCA蛋白测定试剂盒、ECL发光试剂盒等购自北京索莱宝科技有限公司；PVDF膜购自Millipore公司；TNF-α及IL-6酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自武汉博士德公司。
Morris水迷宫装置购自北京众实迪创科技发展有限责任公司；荧光显微镜为Nikon 90i；多功能酶标仪为molecular devices；PCR扩增仪为ABI 7500；凝胶成像系统为Bio-Rad ChemiDoc XRS。
1.2 实验动物健康雄性Wistar大鼠，体质量（280±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号SCXK（京）2016-0006]。动物饲养于SPF动物房，温度22~25 ℃，相对湿度40%~70%，自由饮食饮水。
1.3 动物分组及治疗大鼠按随机数表法分为假手术组（Sham）和模型组，模型组采用双侧颈总动脉夹闭法制作VD模型；假手术组只暴露双侧颈总动脉但不结扎，其余操作同模型组。术后6周，采用Morris水迷宫对模型组大鼠进行筛选，剔除认知功能不合格的动物[6]，并将造模成功的大鼠再次随机分为模型组（VD）、针刺组（Acu）。
针刺组采用“三焦针法”进行治疗，选穴为膻中、中脘、气海、血海（双侧）、足三里（双侧）。假手术组和模型组进行相同程度的捉抓刺激。每日针刺1次，每周治疗6 d，连续4周。
1.4 针刺对VD大鼠海马miR-10a表达及神经炎症的影响莫里斯（Morris）水迷宫评价认知功能：于针刺治疗结束后进行，具体步骤见文献[7]。其中，隐蔽平台实验连续进行5 d，空间探索实验在隐蔽实验结束后，撤除平台立即进行。
水迷宫测试后，将动物麻醉后处死，冰上快速取脑，分离海马组织，液氮速冻，后转移至-80℃保存。采用实时荧光定量（RT-qPCR）法测定miR-10a表达蛋白质印迹（Western blot）法检测NF-κB蛋白表达。ELISA法测定TNF-α及IL-6水平。
RT-qPCR法：取海马组织100 mg，Trizol法提取总RNA，取2 μL总RNA逆转录为cDNA。将cDNA、引物、荧光染料等加入20 μL反应体系中，RT-qPCR法检测。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 12 s；62 ℃ 40 s；共40个循环。引物序列：miR-10a逆转录引物为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC-GAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAA-3'；RT-qPCR引物为5'-TGC GGT ACC CTG TAG ATC CG-3'和5'-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3'；内参U6 snRNA引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。所有样品重复检测3次，2-ΔΔCt法计算miR-10a的相对表达量。
Western blot法检测蛋白表达：取海马组织100 mg，RIPA提取液提取总蛋白，BCA法定量后，蛋白样品进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，分别与总p65（t-p65，1∶1 000）和磷酸化NF-κB p65（p-p65，1∶1 000）的一抗杂交，再经与HRP标记的二抗杂交、化学发光显色等步骤，凝胶图像分析系统测定光密度值。每个样品重复测量3次，取均值分析。实验以β-actin（1∶2 000）作为内参照物。
ELISA法检测炎症因子水平：取海马组织，制作组织匀浆，依照试剂盒说明书于450 nm检测TNF-α及IL-6含量。
1.5 抑制miR-10a对针刺抑制神经炎症的影响将动物分为假手术+ Inh NC组（Sham+Inh NC）、模型+Inh NC组（VD+Inh NC）、针刺+Inh NC组（Acu+Inh NC）、针刺+miR-10a inhibitor组（Acu+Inh）。前3组均给予miR-10a inhibitor NC（Inh NC）注射，针刺+miR-10a inhibitor组则给予miR-10a inhibitor注射。
转染试剂的配制：将350 μg核酸（miR-10a inhibitor NC或miR-10a inhibitor）用100 μL无内毒素的纯水溶解，再加入等量10%葡萄糖溶液（W/V）混匀。取400 μL转染试剂，加入等量10% 葡萄糖溶液，混匀。立即将上述配制好的转染试剂加入核酸溶液中（核酸终浓度为350 μg/mL），混匀，室温静置15 min，进行注射。每只动物每次尾静脉注射1 mL（内含350 μg核酸），于模型成功入组后注射第1次，其后每周注射1次，直至取材。
针刺方法同前。治疗结束，所有动物行水迷宫测试，方法同前。其后，采用前述方法分离动物海马组织行相同检测。
1.6 双荧光素酶报告基因实验检测miR-10a与NF-κB是否直接结合将NF-κB基因3’-UTR克隆至pGL3质粒，构建pGL3-NF-κB野生型载体和突变型载体。取对数生长期的HEK293T细胞，浓度为1×105个细胞/mL，接种于12孔板，于37 ℃、5% CO2培养至60%~70%融合后，更换无双抗培养基培养过夜。更换Opti-MEM培养基，采用Lipofectamine 2000为转染试剂，共转染pGL3- NF-κB野生或突变型载体及miR-10a mimic，37 ℃培养24 h。依据双荧光素酶检测试剂盒说明书处理细胞，多功能酶标仪测定荧光强度。
1.7 统计学方法采用SPSS 17.0分析数据，所有数据均行正态及方差齐性检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。隐蔽平台实验采用重复测量方差分析，其他数据组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett’s T3检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 针刺对VD大鼠海马组织miR-10a表达及神经炎症的影响水迷宫结果表明，模型组隐蔽平台实验的逃避潜伏期较假手术组延长，组间比较差异显著（P < 0.01），说明模型组存在认知障碍。与模型组相比，针刺组的避潜伏期缩短，组间比较差异显著（P < 0.01），提示针刺能改善VD大鼠的认知能力（图 1A）。空间探索实验中，与假手术组相比，模型组大鼠穿越原平台位置的次数减少，首次穿越原平台所需时间延长，组间比较差异显著（P < 0.01），说明VD大鼠的定位能力及空间记忆保持能力受损。针刺组原平台穿越次数均增加、首次穿越原平台所需时间缩短，与模型组相比差异显著（P < 0.01），见图 1B、图 1C。
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| 注：A.隐蔽平台实验中逃避潜伏期；B.原平台穿越次数；C.首次穿越原平台时间。与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。 图 1 水迷宫测试结果 Fig. 1 Morris water maze test results |
海马组织中miR-10a的表达见图 2。模型组大鼠海马组织miR-10a表达较假手术组显著下降（P < 0.01）；针刺组miR-10a表达较模型组上升（P < 0.05）。见图 2。
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| 注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。 图 2 海马组织中miR-10a的表达水平 Fig. 2 Expression level of miR-10a in the hippocampus |
模型组NF-κB t-p65和p-p65蛋白较假手术组表达上升，组间比较差异显著（P < 0.01）。针刺组NF-κB t-p65和p-p65表达较模型组下降（P < 0.05），见图 3。
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| 注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。 图 3 海马组织中NF-κB蛋白的表达情况 Fig. 3 NF-κB protein expression levels in the hippocampus |
模型组的TNF-α、IL-6水平较假手术上升，组间比较差异显著（P < 0.01）；针刺后两者水平均较模型组下降（P < 0.05）。见表 1。
水迷宫结果表明，模型+Inh NC组在隐蔽平台实验中的逃避潜伏期较假手术+Inh NC组延长，组间比较差异显著（P < 0.01），说明VD大鼠存在明显的认知障碍，也说明注射Inh NC对动物认知没有明显影响。与模型+Inh NC组相比，针刺+Inh NC组的避潜伏期缩短，组间比较差异显著（P < 0.01）。针刺+Inh组的逃避潜伏期与模型+Inh NC组相比无显著差异；并明显低于针刺+Inh NC组，组间比较差异明显（P < 0.01），图 4A。空间探索实验中，与假手术+Inh NC组相比，模型+Inh NC组大鼠首次穿越原平台所需时间延长，穿越原平台位置的次数减少，组间比较差异显著（P < 0.01）。针刺+Inh NC组大鼠首次穿越原平台所需时间减少、原平台穿越次数增加，与模型+Inh NC组相比差异显著（P < 0.01）。针刺+Inh组首次穿越原平台所需时间、原平台穿越次数与模型+Inh NC组相比无显著差异，但与针刺+Inh NC组差异明显（P < 0.01），提示针刺治疗不能逆转miR-10a inhibitor的抑制作用（图 4B、图 4C）。
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| 注：A.隐蔽平台实验中逃避潜伏期；B.原平台穿越次数；C.首次穿越原平台所需时间。与假手术+Inh NC组比较，**P<0.01；与模型+Inh NC组比 图 4 给予miR-10a抑制剂后的水迷宫测试结果 Fig. 4 Morris water maze test results after administration of miR-10a inhibitor |
给予miR-10a抑制剂后，海马中miR-10a的表达水平见图 5。模型+Inh NC组大鼠海马miR-10a表达较假手术+Inh NC组显著下降（P < 0.01）；针刺+Inh NC组miR-10a表达较模型+Inh NC组上升（P < 0.05）。针刺+Inh组miR-10a表达低于模型+Inh NC组；且明显低于针刺+Inh NC组（P < 0.01），提示针刺治疗不能逆转miR-10a inhibitor的抑制作用。
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| 注：与假手术+Inh NC组比较，**P<0.01；与模型+Inh NC组比较，#P< 0.05；与针刺+Inh NC组比较，△△P<0.01。 图 5 给予miR-10a抑制剂后海马组织中miR-10a的表达水平 Fig. 5 Expression level of miR-10a in hippocampus after administration of miR-10a inhibitor |
模型+Inh NC组NF-κB t-p65和p-p65蛋白表达较假手术+Inh NC组上升，组间比较差异显著（P < 0.01）。针刺+Inh NC组NF-κB t-p65和p-p65表达较模型+Inh NC组下降（P < 0.05，P < 0.01）。针刺+Inh组NF-κB t-p65和p-p65表达较模型+Inh NC组升高，但未达到显著差异水平；而与针刺+Inh NC组差异明显（P < 0.05，P < 0.01），提示针刺治疗不能逆转miR-10a inhibitor的抑制作用（图 6）。
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| 注：与假手术+Inh NC组比较，**P<0.01；与模型+Inh NC组比较，#P<0.05，##P<0.01；与针刺+Inh NC组比较，△△P<0.01。 图 6 给予miR-10a抑制剂后海马组织中NF-κB蛋白的表达情况 Fig. 6 NF-κB protein expression levels in the hippocampus after administration of miR-10a inhibitor |
模型+Inh NC组的TNF-α、IL-6水平较假手术+Inh NC组上升，组间比较差异显著（P < 0.01）；针刺后两者水平均较模型+Inh NC组下降（P < 0.01）。针刺+Inh组TNF-α、IL-6水平较模型组升高，但未达到显著性差异水平；但明显高于针刺+Inh NC组（P < 0.01）。见表 2。
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双荧光素酶报告基因实验结果表明，转染pGL3-NF-κB野生型质粒时，萤光强度被明显抑制，而转染pGL3-NF-κB突变质粒时，萤光强度与正常水平接近，提示miR-10a可直接作用于NF-κB并抑制其表达。
3 讨论脑缺血导致的炎症反应贯穿VD发生、发展的全过程。动脉粥样硬化是脑缺血的重要危险因素之一。研究显示，炎症反应是动脉粥样硬化形成的基础，动脉粥样硬化的严重程度取决于斑块内炎症反应的程度。大多数促进动脉粥样硬化形成以及斑块破裂的危险因素（如感染、高血压、肥胖、糖尿病、高低密度脂蛋白血症）都可通过炎症反应机制诱导动脉粥样硬化的形成；同时上述因素及动脉粥样硬化也是导致缺血性脑血管病及VD发生的重要危险因素[8-9]。因此控制机体炎症反应可能有助于延缓VD的发展进程。
Micro RNA（miRNA）是一类重要的非编码RNA，其与靶基因mRNA互补结合后抑制靶基因的蛋白质合成，从而参与调控多种生理过程。近年来发现多种miRNAs作为血管炎症的调节者，进而影响血管疾病的发展[10]。其中，miR-10a是较为重要的一种，其在冠心病患者血浆中的水平显著下调，且下调程度与冠心病的严重程度呈负相关[11]。主动脉发生动脉粥样硬化的病理改变之前，该处的内皮细胞已发生损伤并有炎症反应激活，且miR-10a表达较低，炎症标志物单核细胞趋化蛋白-1、IL-8、IL-6、血管细胞黏附分子-1等表达上调[12]。miRNA前体被细胞中Dicer酶切割加工后才能产生成熟的miRNA。敲除小鼠巨噬细胞中的Dicer基因促进了动脉粥样硬化的发生，表现为炎症增强、泡沫细胞和坏死核形成，同时可见miR-10a表达下降；而提高miR-10a表达则增强了Dicer酶的功能，并提高了该缺陷巨噬细胞线粒体呼吸功能、促进脂肪酸氧化代谢、并降低巨噬细胞引起的炎症反应[13]。以上研究均提示，miR-10a在降低炎症反应、发挥对动脉粥样硬化的保护作用方面，具有负反馈调节作用。
在中风患者的血液及脑缺血再灌注大鼠脑组织中，也发现miR-10a表达升高[14]。1项包含530例缺血性卒中患者和403例对照患者的临床研究显示，miR-10a的多态性与缺血性卒中的易感性和卒中后病死率相关[15]。
PAI-1（纤溶酶原激活物抑制剂-1）和ACE（血管紧张素转化酶）是miR-10a的靶基因。PAI-1作为组织纤溶酶原激活剂的调节剂，参与血栓形成和纤溶途径，与血栓形成、器官衰竭、癌症、动脉粥样硬化和组织纤维化等过程有关。ACE异常可导致血液的高凝状态，与血栓形成有关。已证明ACE、PAI-1和缺血性卒中之间存在密切联系[16-17]。采用LPS刺激小鼠海马神经元细胞系HT22细胞，发现细胞中miR-10a表达下降；而细胞凋亡增多，IL-1β、TNF-α和IL-6生成增加；而miR-10a具有抗炎特性，可通过NF-κB等信号通路抑制炎症反应[18]。
目前临床治疗VD的措施有限，多采用胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂、石杉碱甲、胞苷二磷酸胆碱等治疗，但效果仍存在争议[19]。针刺疗法在治疗VD方面有独到优势，前期研究发现，针刺治疗能改善VD患者认知能力和生活自理能力，并可改善患者的细胞免疫功能。基础研究也显示该针法具有抑制神经炎症的作用，但其机制并未完全阐明[20]。
研究发现，针刺组大鼠在水迷宫实验中成绩提高较快、能在较短时间发现水中的逃生平台；即使在逃生平台移除后也能在原平台位置进行主动多次搜索，说明针刺能提高VD大鼠的学习能力和记忆功能。此外，与假手术组相比，VD大鼠海马miR-10a表达下降，NF-κB蛋白及TNF-α、IL-6水平上升，针刺后上述指标出现相反变化。说明针刺能减轻缺血导致的神经炎症损伤；同时miR-10a可能参与了这一过程。转染miR-10a抑制剂后发现，抑制剂组大鼠脑组织中NF-κB蛋白及TNF-α、IL-6水平较模型组上升。证实miR-10a参与了缺血导致的神经炎症损伤过程，其降低导致了损伤加剧。而后的双荧光素酶报告基因实验结果进一步证实，miR-10a可直接作用于NF-κB并抑制其表达，从而降低炎症反应。此外，针刺治疗虽然能提高miR-10a抑制剂空白溶剂组大鼠的认知功能，降低其NF-κB及TNF-α、IL-6水平，但在抑制剂组中却未发现上述作用，表明本研究选用的抑制剂能有效抑制miR-10a的表达，也证实miR-10a介导了针刺减轻神经炎症损伤的作用。
目前尚缺少脑组织中miR-10a调节NF-κB通路的相关研究报道，但对外周组织的研究结果也可为研究提供相关佐证。如外周组织中的miR-10a显著抑制内皮细胞的炎症反应[21]；敲除miR-10a增加IκBα的磷酸化并加重炎症。已知NF-κB是重要的核转录因子，参与机体多种生理过程的调节，包括细胞黏附、凋亡、炎性细胞趋化、细胞外基质的降解等。IκB是NF-κB的抑制蛋白，miR-10a能抑制与IκBα降解相关的两个启动子——丝裂原活化激酶激酶7（MAP3K7）和β-转导蛋白重复序列基因（βTRC）的表达，从而参与调节炎症反应[20]。
总之，本研究结果证实针刺能改善VD大鼠的认知功能，其机制部分与调节miR-10a表达，进而抑制缺血脑组织炎症损伤有关。
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