2023, Vol. 40文章信息
- 安子萌, 付乾芳, 薛雅若, 等.
- AN Zimeng, FU Qianfang, XUE Yaruo, et al.
- 基于网络药理学、分子对接、分子动力学模拟探讨茸菖胶囊治疗小儿癫痫的靶点机制
- Exploration of the target mechanism of Rongchang Capsule in the treatment of epilepsy in children based on network pharmacology, molecular docking and molecular dynamics simulation
- 天津中医药, 2023, 40(4): 495-505
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2023, 40(4): 495-505
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2023.04.16
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文章历史
- 收稿日期: 2022-10-25
2. 国家中医针灸临床医学研究中心, 天津 300193;
3. 南京中医药大学附属医院, 南京 210000
癫痫（epilepsy）是由于大脑皮层神经元异常放电，导致大脑功能短暂性障碍的神经系统疾病[1]。在儿童中，癫痫是常见的慢性神经系统疾病，影响全球0.5%~1%的儿童[2]。经过规范的抗癫痫西药治疗，有70%的患者可以得到有效的控制，然而长期服用抗癫痫西药存在一定的不良反应，且有30%的患者出现耐药[3-4]。此外，此病常共患抑郁、注意缺陷/多动障碍、自闭症等[5]，给患儿及家庭造成了严重的影响。中医药治疗小儿癫痫历史悠久，基础及临床研究均已证实中医药治疗癫痫效果可靠，且在抗痫的同时具有改善认知，调节免疫，减轻西药毒副作用等优势，其作用机制与氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、细胞自噬等通路有关[6-7]。
茸菖胶囊是天津中医药大学第一附属医院马融教授通过40余年治疗小儿癫痫的临床实践，总结出的有效经验方剂（石菖蒲、天南星、天麻、陈皮、半夏、茯苓、甘草、全蝎、僵蚕、鹿茸、菟丝子、冰片），由于癫痫患儿常合并认知障碍，马融教授认为患儿的核心病机为“肾精亏损，风痰内阻”[8]，故治疗以“填精益髓，豁痰息风”法为主，注重抗痫与增智并举。
笔者团队前期研究以自噬调控、线粒体功能调控、雌激素调控为核心，探讨茸菖胶囊治疗癫痫的作用机制。1）自噬调控：茸菖胶囊可通过影响LC3 mRNA[9]、Beclin-1[10]的表达，在形成、融合阶段干预自噬过程，从而保护神经元。2）线粒体功能调控：茸菖胶囊可通过稳定线粒体膜电位、影响ATP与活性氧以及维护细胞内钙稳态，调节其凋亡信号通路相关蛋白表达[11]，起到抗癫痫的作用。3）雌激素水平：茸菖胶囊可通过降低血清中雌激素水平、抑制海马神经元雌激素α、β受体减少癫痫大鼠动情期的癫痫发作[12]。4）茸菖胶囊可对负向调控通路AMPK/mTOR信号有意义，并呈时间依赖性。目前对于茸菖胶囊干预癫痫的机制研究均为单靶点或单通路，然而由于中药复方的复杂性，作用机制是通过多种活性分子作用于多种靶点，所以需要多靶点、多通路研究，随着网络药理学的发展，可以从微观角度探寻茸菖胶囊治疗癫痫的分子机制，故本文通过网络药理学、分子对接及分子动力学模拟探讨茸菖胶囊的多靶点机制。
1 资料和方法 1.1 活性成分筛选通过检索中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）、中医药信息数据库（TCMID，https://bidd.group/TCMID/index.html）、中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）以及文献检索，对茸菖胶囊中所含药物成份进行检索，并将检索的成份根据TCMSP数据库中口服生物利用度（OB）≥30%[13]，药物相似性（DL）≥0.18[14]进行筛选，最终确定茸菖胶囊中药物生物活性成分。
1.2 生物活性成份靶点预测通过TCMSP数据库检索生物活性成分中对应的靶点名称，并根据蛋白质功能知识库（UniProt，https://www.uniprot.org/）将靶点名称通过“Reviewed”及“Human”进行筛选，转换为基因名称并删除重复靶点信息，最终获得基因名称。
1.3 潜在作用靶点预测根据癫痫疾病关键词“epilepsy”在人类基因数据库（GeneCards，https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https://omim.org/）、DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）中检索数据，并删除重复靶点。将疾病靶点信息与药物靶点信息取交集，得到茸菖胶囊干预癫痫的潜在靶点。
1.4 “药物-活性成分-靶点”网络构建将1.2中相关靶点与1.3的潜在作用靶点取交集，并导入到Cytoscape3.7.2软件中，构建“茸菖胶囊-活性成分-靶点”网络图，并使用Network Analyzer功能计算活性成分连接度。
1.5 蛋白相互作用（PPI）网络构建及拓扑分析将交集靶点输入到String数据库（https://string-db.org/）中，限定研究生物为人类，设置最低互作评分为0.4，并删除孤立点，获取蛋白相互作用网络关系，通过Cytoscape软件内插件CytoNCA对蛋白质相互作用关系进行分析，并筛选出大于2倍中位数的蛋白。
1.6 GO、KEGG功能富集分析使用R软件获取癫痫潜在作用靶点的基因ID，并对潜在作用靶点进行GO、KEGG富集分析，得到生物学过程富集分析（BP）、细胞组成富集分析（CC）、分子功能富集分析（MF）以及潜在的作用通路。设定pvalueCutoff = 0.05，qvalueCutoff = 0.05，最终根据p值选取排名前10、20位的绘制GO、KEGG功能富集分析图。
1.7 药物成份-靶点-KEGG网络关系图根据KEGG中前20条通路、连接度排名前10的药物成份，及对应的相关靶点，建立药物成份-靶点-KEGG通路关系，通过Cytoscape中Network Analyzer功能计算药物成份及靶点的连接度、中介中心性以及接近中心性，并绘制药物成份-靶点-KEGG网络关系图。
1.8 分子对接选取1.7中连接度排名前6的靶点及连接度前5的活性分子，通过Pub Chem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成份2D结构并进行能量最小化处理。通过Uniprot数据库下载靶点蛋白，使用PyMOL软件将靶点蛋白进行去水处理。使用AutoDockTools 1.5.7对活性成分进行加氢处理。使用Vina软件进行分子对接，根据Affinity数值来判断靶点蛋白与活性成份间结合情况。其中Affinity数值越小对接活性越好。当Affinity≤-4.25 kcal/mol时，认为靶点与分子间存在结合活性；Affinity≤-5时，认为结合较为紧密；Affinity≤-7时，认为靶点蛋白与活性分子有强烈的结合活性[15]。
1.9 分子动力学模拟采用Gromacs 2020.6软件对体系进行模拟。力场选择Charmm36力场，水模型选择TIP3P模型。对体系进行溶剂化、离子平衡（设定离子浓度为0.145 M，模拟人体环境）后，分别将体系升温至310 K以及1bar，最后对该体系进行100 ns的分子动力学模拟。非键相互作用的cut-off值设定为1.2 nm，并运算长距离静电的相互作用。
2 结果 2.1 药物生物活性成份筛选通过BATMAN-TCM、TCMID、TCMSP数据库及文献检索茸菖胶囊活性成分，并根据TCMSP中OB≥30%、DL≥0.18进行筛选，并剔除无对应靶点的活性成份，最终共筛选出135个活性成分，其中石菖蒲4个、天南星5个、天麻3个、陈皮5个、半夏9个、茯苓4个、甘草85个、全蝎1个、僵蚕5个、鹿茸3个、菟丝子8个、冰片3个，其中有9种交集化合物，删除重复项后共获得117个茸菖胶囊活性成份。
2.2 茸菖胶囊治疗癫痫潜在靶点的预测结果通过TCMSP数据库下载茸菖胶囊中所对应的靶点信息，共获得323个靶点；分别在GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库获得癫痫相关靶点，合并删除重复项，最终获得2 148个靶点。将两者取交集，最终获得115个茸菖胶囊治疗癫痫的潜在作用靶点，并绘制Venn图（图 1）。
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| 图 1 茸菖胶囊与癫痫相关靶点Venn图 Fig. 1 Venn diagram of Rongchang capsule and epilepsy related targets |
使用Cytoscape软件，构建“药物-活性成分-靶点”网络图（图 2），并计算活性成分度值。通过度值可以判断茸菖胶囊治疗癫痫中排名前5的核心化合物为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素以及川陈皮素，其中前4种化合物均在多种药物中出现，对治疗癫痫具有重要作用（表 1）。
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| 图 2 “药物-活性成分-靶点”网络图 Fig. 2 "Drug active ingredient target" network diagram |
将交集靶点输入到String数据库，获得PPI信息，共含有113个节点信息，1 353条边，平均度值为23.9，使用Cytoscape软件绘制PPI网络图（图 3），颜色越深，体积越大，表明其连接度越大，其中连接度排名前6的靶点为AKT1、TNF、IL6、TP53、CASP3、ESR1，这些靶点在治疗癫痫中可能具有重要作用。使用Cytoscape中CytoNCA插件，进一步分析PPI数据，筛选出所有条件均大于2倍中位数的靶点为核心靶点（图 4），共含18个节点信息，这些靶点可能是茸菖胶囊治疗癫痫的关键靶点。
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| 图 3 茸菖胶囊-癫痫PPI网络图 Fig. 3 Rongchang Capsule-epilepsy PPI network |
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| 图 4 核心靶点PPI网络图 Fig. 4 PPI network diagram of core target |
通过Bioconductor插件对茸菖胶囊治疗癫痫相关靶点进行GO、KEGG功能富集分析（图 5），GO分析中共得到2 330条数据，其中包含2 113条BP相关条目，主要涉及类固醇代谢过程、对金属离子的反应、细胞对药物的反应，包含84条CC相关条目，主要涉及突触前膜的内在成分、膜筏、膜微区，包含133条MF相关条目，主要涉及细胞因子活性、铵离子结合、核受体活性。在KEGG通路分析中，茸菖胶囊治疗癫痫的通路机制可能与脂质和动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路、白介素-17（IL-17）信号通路。
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| A：GO与BP、CC、MF富集分析；B：KEGG富集分析，颜色越红表明富集越显著，线条越长表明富集在该通路的基因数量越多 图 5 GO、KEGG功能富集分析图 Fig. 5 Functional enrichment analysis of GO and KEGG |
使用Cytoscape软件构建茸菖胶囊-靶点-KEGG网络关系图（图 6），该网络图共包含59个节点，252条边，其中红色倒三角代表KEGG信号通路，橙色菱形代表茸菖胶囊的活性成分，蓝色长方形代表靶点信息，蓝色面积越大，表明该靶点对癫痫的影响越大。对网络进行拓扑分析可知，MOL000098（槲皮素）连接度、中心性最高，预测槲皮素为茸菖胶囊干预癫痫的主要活性分子（表 2）。MAPK3、AKT1、PTGS2、CASP3、FOS为网络中连接度排名前5的靶点（表 3）。通过该图可知茸菖胶囊活性分子可干预多个靶点，各靶点相互关联作用于不同通路，证明茸菖胶囊可通过多条通路协同干预癫痫。
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| 图 6 茸菖胶囊-靶点-KEGG网络关系图 Fig. 6 Rongchang capsule target KEGG network |
使用Cytoscape软件构建药物-靶点-前期研究通路图（图 7），其中红色倒三角表示前期研究的信号通路，橙色菱形代表茸菖胶囊药物组成，绿色长方形代表靶点信息，并绘制药物-靶点-前期研究通路表（表 4）。
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| 图 7 药物-靶点-前期研究通路图 Fig. 7 Drug target previous study pathway |
将活性成分中连接度排名前5的分子以及连接度排名前6的靶点蛋白进行分子对接，共获得30对对接结果（图 8）。其中对接结合最紧密的为ESR1与柚皮素，得分为-8.9 kcal/mol，并将结合能力前6的组合进行可视化（图 9）。
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| 图 8 分子对接结果热图 Fig. 8 Heat diagram of molecular docking results |
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| A: naringenin-ESR1;B: kaempferol-TP53;C: naringenin-TP53;D: quercetin-TP53;E: kaempferol-CASP3;F: quercetin-CASP3 图 9 部分靶点-活性分子对接可视化 Fig. 9 Visualization of partial target active molecule docking |
选取分子对接中结合最紧密的组合ESR1与柚皮素进行分子动力学模拟。
2.9.1 均方根偏差均方根偏差（RMSD）[16]被认为是衡量体系稳定性的标准。平均RMSD值越小，体系越稳定。在模拟的100 ns过程中，RMSD值一直保持较低且平稳的状态（图 10）。显示配体与受体的结合比较紧密，复合物较稳定。
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| 图 10 均方根偏差折线图 Fig. 10 RMSD line chart |
均方根涨落（RMSF）[17]可以表征小分子配体对蛋白质空间结构的波动。值越大，证明蛋白质的残基与小分子相互作用越重。根据图 11观察可知，Res 307-Res 350、Res525-Res551在模拟过程中的RMSF值较大，提示这些残基可能是关键残基，并对关键残基标为黄色展示（图 12）。
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| 图 11 均方根涨落折线图 Fig. 11 RMSF line chart |
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| 图 12 柚皮素关键残基可视化 Fig. 12 Visualization of key residues of naringen |
回旋半径（ROG）[18]可以表征模拟过程中蛋白质结构的紧实度。分析可得，蛋白质在模拟过程中，回旋半径较小，均小于2 nm，说明蛋白质结构比较紧密，复合物较稳定（图 13）。
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| 图 13 回旋半径折线图 Fig. 13 ROG line chart |
中医认为，癫痫，以肾精亏虚多见，“肾藏精生髓”“脑为髓之海”，肾虚则髓空，髓少则脑失所养而引发癫痫，并可导致认知障碍等表现[19]。茸菖胶囊中鹿茸、石菖蒲豁痰开窍，温肾益髓共为君药；菟丝子温补脾肾，助鹿茸温肾益髓，全蝎、天南星、天麻、僵蚕化痰通络，息风止痉，共为臣药。半夏、茯苓、陈皮燥湿化痰健脾，共为佐药。诸药共用可达“豁痰开窍，补益脾肾”之功。
3.1 活性成分分析癫痫与炎症反应、氧化应激密切相关，其中大脑的异常放电区可激活神经炎症分子[20]，大脑产生的活性氧分子可参与氧化应激反应，诱发癫痫的发生[21]。研究中连接度最高的槲皮素对炎症反应、氧化应激均有抑制作用，其可降低小胶质细胞释放促炎细胞因子IL-1β及TNF-α[22]；也可穿透血脑屏障，改善氧化损伤、下调炎症反应[23]；并且动物实验表明，槲皮素可改善认知障碍[24]。核心化合物中的山奈酚、柚皮素、槲皮素均归属黄酮类化合物，该化合物可与苯二氮卓受体位点结合，调节GABA-A受体，改善氧化损伤[25-26]。此外甾醇类化合物中β-谷甾醇也有抗癫痫作用，动物实验表明，β-谷甾醇可提高海马神经元细胞活力，且无毒副作用[27]。因此茸菖胶囊中活性成分可能通过减轻神经炎症反应、下调氧化应激反应可起到抗癫痫的作用。
3.2 相关靶点分析相关靶点研究中，关系密切的为细胞凋亡、炎症反应及雌激素受体。其中核心靶点中的AKT1、CASP3、TP53均参与细胞凋亡过程。AKT1在许多神经系统疾病中发挥抗凋亡、保护神经元的作用[28]。AKT1磷酸化是机体的一种保护性反应，癫痫发作时可引起该反应，激活PI3K/Akt信号通路，从而保护神经元[29]，在癫痫伴海马硬化症的患者中可检测到AKT1的水平显著升高也验证其作用[30]。同时CASP3处于凋亡程序的下游[31]，TP53则参与转录[32]，两者也与细胞凋亡及细胞周期调控有关。此外，炎症因子与癫痫的发生密不可分，一方面，癫痫的发作可引起神经炎症改变，另一方面，炎症因子继而改变神经的兴奋性，进一步加重神经损伤[33]，而研究的核心靶点TNF、IL-6被认为与脑内炎症有关[34]，两者与体内自由基的形成有关，可导致神经元毒性的增加[35]。团队前期研究也发现，雌激素具有致痫作用[36]，而ESR1作为雌激素受体，显示其与子痫的发生密切相关[37]。因此茸菖胶囊中核心靶点可能通过调控细胞凋亡、炎症反应及雌激素水平起到抗癫痫的作用。
3.3 GO分析GO分析中主要BP涉及类固醇代谢、对金属离子的反应、对抗生素的反应等；MF涉及细胞因子活性、铵离子结合、核受体活性等。这与部分专家的研究结果类似，如潘岗等[38]总结了类固醇激素在难治性癫痫中的应用，M Lévesque等[39]认为神经类固醇可能是治疗局灶性癫痫病的新靶点。
3.4 KEGG分析团队前期研究已证实：茸菖胶囊可降低血清中雌激素水平、干预自噬过程、负向调控AMPK、mTOR信号通路，发挥抗癫痫作用，但尚无活性成分-靶点之间的研究。研究在验证了团队前期研究的基础上，预测了4条通路中的活性成分-靶点关系，形成活性成分-靶点-通路完整的作用方式，为后续药物-靶点的基础研究提供参考。
此外文章中预测了茸菖胶囊治疗癫痫最为密切的3个KEGG通路。1）脂质和动脉粥样硬化通路：人体中枢神经系统中约60%是脂质，海马体中脂质的过氧化会导致癫痫的发生。有证据表明，颞叶癫痫患者中脂质的稳定性遭到破坏，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺均会减少[40]，而两者具有抗惊厥作用，它们可以通过过氧化物酶体激活受体、拮抗神经炎性反应而抗痫[41]。2）AGE-RAGE信号通路：在生理状态下，人体RAGE含量不高，但炎症状态时RAGE含量增加[42]，其可通过该通路激活NF-κB的核转位，增加促炎因子的释放[43]，而NF-κB的激活也诱导RAGE进一步合成，导致炎症反应加重。同时，该通路的激活可产生大量的活性氧，通过氧化应激反应介导血管内皮损伤[44]，而抗氧化剂已被证明为神经保护剂，可减缓癫痫引起的大脑损伤[21]。3）IL-17信号通路癫痫的发作与神经炎性反应息息相关，而该通路则是其中重要的一支。IL-17主要来源于辅助性T细胞17，它可以破坏血脑屏障，并通过激活中性粒细胞和刺激促炎细胞因子的产生，来诱导神经元凋亡、促进炎症反应发生[45]，相关研究也证实其浓度与癫痫发病的严重程度成正比[46]。IL-17在难治性癫痫[47]、自身免疫性癫痫[48]患者血清及脑脊液中的含量均显著升高，也验证了癫痫与IL-17的密切关系。这些通路与炎症反应、氧化应激密切相关，也验证了活性成分、靶点分析中潜在的作用机制。
3.5 分子对接及分子动力学模拟分析分子对接中结果均Affinity≤-5 kcal/mol，表明所有对接结果均较紧密。Affinity≤-7 kcal/mol的共有12组，表明40%的对接结果有强烈的结合性，提示茸菖胶囊可能通过黄酮类、甾醇类化合物发挥抗痫作用。选取结合最紧密的组合ESR1与柚皮素进行分子动力学模拟，提示该化合物结合紧密，复合物稳定，提示调节雌激素水平可能是茸菖胶囊治疗癫痫的潜在作用机制。
4 总结研究通过网络药理学、分子对接及分子动力学模拟的方法，构建茸菖胶囊药物活性分子，蛋白质相互作用网络、GO及KEGG富集分析，总结出茸菖胶囊中核心活性分子、靶点及通路。预测了茸菖胶囊通过下调氧化应激反应、神经炎性反应及雌激素水平达到控制癫痫的作用。然而，网络药理学是基于当前数据库及已验证的实验数据进行分析的，由于实验的方法，操作不尽相同，可能导致研究结果出现假阴性及假阳性的概率[49]。后续笔者将继续关注茸菖胶囊治疗癫痫的药理机制，进一步进行基础实验验证，更加深入探讨其活性成分、靶点、通路间的关系。
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2. National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300193, China;
3. Affiliated Hospital of Nanjing University of traditional Chinese Medicine, Nanjing 210000, China