哮喘是一种肺部气道慢性炎症性疾病，其特征是胸闷、咳嗽、气短和喘息，临床表型异质性很大。全世界有超过3亿人是哮喘患者^[1]。除了遗传因素外，空气污染和过敏原等环境因素也会导致哮喘^[2]。目前，吸入性皮质类固醇和长效β2受体激动剂被认为是治疗哮喘最常见的药理学选择。尽管这些药物可以减轻气道炎症并缓解呼吸道症状，但一些哮喘患者对基于皮质类固醇的治疗反应不佳，甚至会出现严重的不良反应^[3]。因此，迫切需要寻找能够缓解气道炎症的替代治疗方案。鹰嘴豆芽素A（BCA）是一种生物活性异黄酮植物雌激素，可以从鹰嘴豆和红三叶草中分离出来，其具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗肿瘤活性^[4]。先前的研究显示，BCA可用于治疗卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘^[5]。但具体机制尚不完全清楚。Toll样受体4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）/NOD样受体蛋白3（NLRP3）信号通路可通过调节促炎细胞因子的产生参与介导炎症反应^[6]。已有研究报道，下调TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路可减轻急性肺炎幼龄大鼠的炎症反应^[7]。而BCA能否通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路影响OVA诱导哮喘大鼠的气道炎症尚不明确。因此，研究主要探究BCA对OVA诱导哮喘大鼠的气道炎症的影响以及其作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

72只，SPF级雄性SD大鼠购自广东明珠生物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（粤）2022-0061。所有动物实验符合3R原则，并获得本院动物伦理委员会的批准。

1.2 主要试剂

BCA（货号：PB3024，规格：20 mg）、脂多糖（LPS，货号：PC1303）、地塞米松（Dex，货号：PB3856）购自北京普非生物公司；氢氧化铝凝胶溶液（货号：EHJSW-134002）购自厦门慧嘉生物公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α，货号：EK-R38696）、白细胞介素1β（IL-1β，货号：EK-R36877）、干扰素-γ（IFN-γ，货号：EK-R36844）酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒购自博辉生物公司；兔源一抗嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin，货号：ab133604）、TLR4（货号：ab217274）、p-NF-κB p65（货号：ab239882）、NF-κB p65（货号：ab76311）、NLRP3（货号：ab263899）、β-actin（货号：ab8226）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（货号：ab205718）均购自英国abcam公司。

1.3 方法 1.3.1 OVA诱导哮喘大鼠模型的构建

将大鼠适应性地喂养1周后，在第1天和第8天向大鼠腹腔注射10 mg OVA和100 mg氢氧化铝凝胶，第14天开始用2% OVA溶液雾化激发哮喘，每日1次，每次30 min，连续10 d以构建OVA哮喘大鼠模型^[8]。若大鼠出现呼吸急促、喘息、打喷嚏、鼻孔有白色黏性分泌物等症状则表明模型构建成功。

1.3.2 动物分组

将SD大鼠随机分为对照（CK）组、模型（Model）组、低剂量BCA组（BCA-L组）、高剂量BCA组（BCA-H组）、地塞米松阳性对照组（Dex组）、BCA-H+LPS（TLR4激活剂）组，每组12只。除CK组外，其他组均按1.3.1中描述的方法构建OVA哮喘大鼠模型。建模成功24 h后，进行给药处理，BCA-L组^[9]大鼠灌胃25 mg/kg BCA且还需腹腔注射等体积的生理盐水；BCA-H组^[9]大鼠灌胃100 mg/kg BCA且还需腹腔注射等体积的生理盐水；Dex组^[10]大鼠灌胃1 mg/kg Dex且还需腹腔注射等体积的生理盐水；BCA-H+LPS组^[11]大鼠灌胃100 mg/kg BCA且还需腹腔注射0.1 mg/kg LPS，CK组、Model组大鼠灌胃等体积的生理盐水且还需腹腔注射等体积的生理盐水。每日1次，持续10 d。

1.3.3 标本收集

末次给药24 h后，利用动物肺功能测定仪检测大鼠肺功能指标变化；肺功能指标检测完成后，处死大鼠，分离并暴露出大鼠颈部气管，在气管处剪一切口，用一软管将1 mL生理盐水注入大鼠气管中，缓慢回抽液体，按照上述方法洗3次，3次所得的2.4 mL溶液即为支气管肺泡灌洗液（BALF）。将BALF离心收集的上清液保存于-80 ℃中，收集离心所得的沉淀用于细胞涂片。再将大鼠肺组织分离，分为两部分，一部分固定于4%多聚甲醛中，另一部分冻存于-80 ℃中。

1.3.4 肺功能指标的检测

利用动物肺功能测定仪检测大鼠吸气阻力、呼气阻力、肺通气顺应性的变化。

1.3.5 吉姆萨（Giemsa）检测BALF中细胞总数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数和中性粒细胞数

将1.3.3中的细胞沉淀用100 μL PBS重悬，取0.1 μL重悬液置于载玻片上，经晾干、涂片、固定后，进行Giemsa染色，最后利用显微镜观察细胞总数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数的变化。

1.3.6 ELISA检测BALF中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平

严格按照试剂盒说明书检测BALF中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平。

1.3.7 苏木精-伊红染色法（HE）检测大鼠肺组织病理变化

用4%多聚甲醛固定肺组织24 h，然后包埋在石蜡中，切成5 μm厚的切片，用HE染色，以评估炎症细胞浸润支气管周围和血管周围的情况。

1.3.8 免疫组化检测大鼠肺组织中嗜酸性粒细胞走趋化因子（Eotaxin）表达

在60 ℃的培养箱中加热2 h后，石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复、封闭后，加入一抗Eotaxin（1∶500）在4 ℃下过夜，然后再加入羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）在37 ℃下孵育30 min，Image J软件用于评估Eotaxin染色阳性面积。

1.3.9 蛋白质印迹法（Western Blot）检测大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3蛋白表达

用RIPA裂解缓冲液提取肺组织总蛋白，将蛋白质进行定量、电泳、转膜、封闭后，加入一抗TLR4（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶2 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）在4 ℃下孵育过夜，再加入二抗（1∶2 000）在37 ℃下孵育1 h，使用ECL试剂显色蛋白质条带，Image J软件确定蛋白质条带的灰度值。

1.4 统计学方法

SPSS 24.0软件用于统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）。多组间比较采用单因素方差分析，组间采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 BCA对哮喘大鼠肺功能的影响

与CK组比较，Model组大鼠吸气阻力、呼气阻力升高，肺通气顺应性降低（P < 0.05）；与Model组比较，BCA-L组、BCA-H组、Dex组大鼠吸气阻力、呼气阻力降低，肺通气顺应性升高（P < 0.05）；与BCA-L组比较，BCA-H组、Dex组大鼠吸气阻力、呼气阻力降低，肺通气顺应性升高（P < 0.05）；与BCA-H组比较，BCA-H+LPS组大鼠吸气阻力、呼气阻力升高，肺通气顺应性降低（P < 0.05）。见表 1。

2.2 BCA对哮喘大鼠BALF中炎性细胞数的影响

与CK组比较，Model组大鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数升高（P < 0.05）；与Model组比较，BCA-L组、BCA-H组、Dex组大鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数降低（P < 0.05）；与BCA-L组比较，BCA-H组、Dex组大鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数降低（P < 0.05）；与BCA-H组比较，BCA-H+LPS组大鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数升高（P < 0.05）。见表 2。

2.3 BCA对哮喘大鼠BALF中炎性细胞因子的影响

与CK组比较，Model组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平升高（P < 0.05）；与Model组比较，BCA-L组、BCA-H组、Dex组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平降低（P < 0.05）；与BCA-L组比较，BCA-H组、Dex组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平降低（P < 0.05）；与BCA-H组比较，BCA-H+LPS组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平升高（P < 0.05）。见表 3。

2.4 BCA对哮喘大鼠肺组织病理损伤的影响

与CK组比较，Model组大鼠肺组织中的支气管及血管周围炎性细胞浸润明显；与Model组比较，BCA-L组、BCA-H组、Dex组大鼠肺组织中的支气管及血管周围炎性细胞浸润减轻；与BCA-H组比较，BCA-H+LPS组大鼠肺组织病理损伤严重。见图 1。

2.5 BCA对哮喘大鼠肺组织中Eotaxin表达的影响

与CK组比较，Model组大鼠肺组织中Eotaxin阳性染色面积百分数升高（P < 0.05）；与Model组比较，BCA-L组、BCA-H组、Dex组大鼠肺组织中Eotaxin阳性染色面积百分数降低（P < 0.05）；与BCA-L组比较，BCA-H组、Dex组大鼠肺组织中Eotaxin阳性染色面积百分数降低（P < 0.05）；与BCA-H组比较，BCA-H+LPS组大鼠肺组织中Eotaxin阳性染色面积百分数升高（P < 0.05）。见图 2和表 4。

2.6 BCA对哮喘大鼠肺组织中TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白表达的影响

与CK组比较，Model组大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3蛋白表达升高（P < 0.05）；与Model组比较，BCA-L组、BCA-H组、Dex组大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3蛋白表达降低（P < 0.05）；与BCA-L组比较，BCA-H组、Dex组大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3蛋白表达降低（P < 0.05）；与BCA-H组比较，BCA-H+LPS组大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3蛋白表达升高（P < 0.05）。见图 3和表 5。

3 讨论

近年来，国内外流行病学研究表明，哮喘发病率呈逐年上升趋势^[12]。尽管研究者们已经为哮喘治疗做出了巨大的努力，然而，由于哮喘的异质性和复杂性，有效控制哮喘仍然很困难^[13]。因此，开发新的治疗哮喘的方法具有重要意义。相关研究显示，OVA诱导的小鼠BALF中存在大量炎性细胞，如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等^[14]；支气管上皮细胞中的炎性细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β促进了哮喘的发生，抑制促炎介质可显著缓解过敏性哮喘的进展^[15-16]；Eotaxin-1是嗜酸性粒细胞募集和哮喘进展的重要趋化因子^[17]。本研究通过利用OVA和氢氧化铝诱导哮喘大鼠模型，结果显示，与CK组比较，Model组大鼠肺功能指标异常，BALF中细胞总数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数、TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平升高，肺组织中的支气管及血管周围炎性细胞浸润明显，肺组织中Eotaxin阳性染色面积百分数升高，表明Model组大鼠存在气道炎症反应，提示造模成功。

BCA是一种O-甲基化异黄酮，存在于红三叶草、卷心菜、鹰嘴豆和各种草药产品中，具有抗氧化、抗炎等活性^[18]。据报道，BCA对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌炎症因子具有明显抑制作用^[19]；BCA通过抑制炎症反应来减轻动脉粥样硬化^[20]。以上研究表明BCA具有抗炎作用。本研究结果与其是一致的，本研究显示，低、高剂量BCA均可减轻哮喘大鼠气道炎症反应，且BCA剂量越高，对应的趋势越明显；而BCA-H组与Dex组比较，大鼠气道炎症反应减轻程度差异不显著，提示BCA可减轻OVA诱导哮喘大鼠的气道炎症反应。

TLR4的激活促进NF-κB的升高，而NF-κB调节促炎细胞因子的表达。此外，NLPR3在哮喘期间在肺组织中募集并增强炎症反应^[21]。相关研究表明，安川颗粒通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路缓解OVA诱导小鼠的哮喘症状^[22]；抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路可改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺组织损伤^[23]。提示抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路可发挥对肺组织的保护作用。本研究显示，低、高剂量BCA均可抑制哮喘大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65、NLRP3蛋白表达，且BCA剂量越高，对应的趋势越明显，提示BCA可能通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路减轻OVA诱导哮喘大鼠的气道炎症。为了验证该设想，本研究在高剂量BCA处理的基础上再加上TLR4激活剂LPS干预哮喘大鼠，结果显示，LPS减弱了高剂量BCA对哮喘大鼠气道炎症的抑制作用。证实了BCA可能通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路减轻OVA诱导哮喘大鼠的气道炎症。

综上所述，BCA可能通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路减轻OVA诱导哮喘大鼠的气道炎症，推测BCA可能成为治疗哮喘的潜在药物。