糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见微血管并发症，是导致终末期肾病及糖尿病患者死亡的首要因素^[1]。持续高血糖所致肾纤维化是DN发生发展的重要病理机制^[2]，因此，靶向抑制肾纤维化对延缓DN进展至关重要。藏红花素为传统中药藏红花的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等多种生物学活性^[3-4]；并且藏红花素对博来霉素所致肺纤维化具有明显抑制作用^[5]。

有研究发现，藏红花素能够通过抑制氧化应激和炎症反应等对DN大鼠具有一定的保护作用^[6-7]，但藏红花素对DN大鼠肾纤维化是否具有抑制作用尚未见文献报道。研究通过制备DN大鼠模型并给予藏红花素进行治疗，以二甲双胍做为阳性对照药物，探讨藏红花素对DN大鼠肾纤维化的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠60只，7周龄，体质量210~240 g，由河北医科大学实验动物学部提供[SYXK（冀）2018-004]，分笼饲养于温度23~25 ℃、相对湿度55%~65%、光照黑暗12 h∶12 h的清洁环境，自由饮水进食。实验方案经开滦总医院伦理委员会审查批准。

1.2 药物与试剂

藏红花素、链尿佐菌素（批号E190805b、024K1211，美国Sigma公司）；二甲双胍（批号20200417，天津亚宝药业科技有限公司）；尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）试剂盒（批号91207、200109，购自南京建成生物工程研究所）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、马森（Masson）染色试剂盒、增强化学发光（ECL）超敏发光试剂盒（批号G1120、G1340、SW2030，北京索莱宝科技有限公司）；克洛索蛋白（Klotho）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、磷酸化Smad2（p-Smad2）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号bs-2925R、bs-0086R、bs-2224R、bs-0061R，北京博奥森生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器

GT-1640型血糖仪（长春迈德赛斯医疗器械有限公司）；UF-1000i型尿液分析仪（日本SYSMEX株式会社）；RM2245型切片机（德国Leica公司）；DYCZ-24DN型电泳仪、DYCZ-40D型转膜仪（北京六一生物科技有限公司）；BX51 F32H01型光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.4 实验方法 1.4.1 动物分组、模型制备与给药

适应性饲养1周后，按照随机数字表法，将60只大鼠随机分为正常对照组、模型组、二甲双胍组和藏红花素低、中、高剂量组。正常对照组大鼠常规饲料饲养，其余各组大鼠给予高糖高脂饲料（常规饲料67.5%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%）饲养4周后禁食禁水12 h，腹腔注射浓度1%的链尿佐菌素（30 mg/kg）；72 h后检测空腹血糖（FBG）≥16.7 mmol/L，尿糖（+++）或（++++），可认为DN大鼠模型造模成功^[8]。正常对照组和模型组均灌胃给予生理盐水，二甲双胍组灌胃500 mg/kg^[9]，藏红花素低、中、高剂量组分别灌胃25、50、100 mg/kg^[10]，每日1次，疗程12周。

1.4.2 大鼠FBG水平与体质量检测

所有大鼠均于末次给药24 h后称量体质量并检测FBG水平。

1.4.3 肾功能指标检测

末次给药完成后，收集24 h尿液，通过磺基水杨酸法测定UPro；末次给药24 h后实施麻醉，经腹主动脉取血并离心（离心半径10 cm，转速1 500 r/min，时间10 min）取血清，然后按照试剂盒说明依步进行处理后检测BUN、Scr含量。

1.4.4 肾组织病理学及纤维化检查、胶原容积分数（CVF）计算

采血完成后，颈椎脱臼处死后取双侧肾组织，左侧肾脏置于4%甲醛溶液固定72 h，常规脱水和透明处理后，石蜡包埋、切片（厚度5 μm），按照试剂盒说明行HE染色和Masson染色，然后通过光学显微镜观察肾组织病理学改变和纤维化状况（蓝色为胶原着色）。通过图像分析系统检测CVF，CVF（%）=（胶原面积/视野总面积）×100%。

1.4.5 肾组织蛋白表达检测

取右侧肾脏剪碎后加入蛋白裂解液，匀浆后4 ℃离心（离心半径10 cm，转速12 000 r/min，时间20 min）取沉淀，二喹啉甲酸（BCA）法检测总蛋白浓度，以30 μg蛋白量上样、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（80 V，40 min，160 V，90 min）分离蛋白、湿法转聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（300 mA，90 min）、5%脱脂奶粉常温封闭90 min后，加目标蛋白和内标（β-actin）一抗4 ℃孵育12 h，TBST洗膜后加二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后加ELC发光剂，通过凝胶成像仪显示蛋白条带，以β-actin为内参、通过条带灰度值半定量目标蛋白表达。

1.5 统计学方法

应用SPSS 20.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 藏红花素对DN大鼠FBG的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠FBG水平显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，二甲双胍组和藏红花素中、高剂量组FBG水平显著降低（P < 0.01），二甲双胍组与藏红花素高剂量组间FBG水平差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

2.2 藏红花素对DN大鼠体质量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠体质量显著降低（P < 0.01）；与模型组比较，二甲双胍组和藏红花素中、高剂量组体质量显著升高（P < 0.05或P < 0.01），且藏红花素高剂量组大鼠体质量显著高于二甲双胍组（P < 0.05）。见表 1。

2.3 藏红花素对DN大鼠肾功能的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠UPro和血清BUN、Scr水平显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，二甲双胍组和藏红花素中、高剂量组UPro和BUN、Scr水平显著降低（P < 0.01），且藏红花素高剂量组大鼠UPro和BUN、Scr水平显著低于二甲双胍组（P < 0.05或P < 0.01）。见表 2。

2.4 藏红花素对DN大鼠肾组织病变的影响

正常对照组大鼠肾组织结构未见异常；模型组呈现肾小球体积增大，系膜区增宽、基底膜增厚，肾小管扩张，大量炎性细胞浸润等病理性改变；与模型组比较，二甲双胍组和藏红花素各剂量组肾组织病变不同程度减轻；藏红花素高剂量组仅可见肾小球体积轻度增大、基底膜增厚，效果优于其他组。见图 1。

2.5 藏红花素对DN大鼠肾纤维化的影响

正常对照组大鼠肾组织结构清晰，肾小球和肾间质可见少量胶原；模型组肾小球系膜和基底膜、肾间质区可见大量呈弥漫性分布的胶原沉积；与模型组比较，二甲双胍组和各剂量藏红花素组肾小球、肾间质区胶原沉积减少，其中藏红花素高剂量组肾小球、肾间质仅可见丝状胶原沉积。VF计算结果：与正常对照组CVF（12.06±1.97）%比较，模型组CVF（66.83±7.54）%显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，二甲双胍组（23.57±3.86）%和藏红花素低剂量组（50.13±6.24）%、中剂量组（37.92±5.03）%、高剂量组（17.05±2.88）%CVF显著降低（P < 0.01）；藏红花素高剂量组CVF（17.05±2.88）%显著低于二甲双胍组（23.57±3.86）%，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图 2。

2.6 藏红花素对DN大鼠肾组织Klotho、TGF-β1、p-Smad2蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组Klotho相对表达量显著降低而TGF-β1、p-Smad2相对表达量显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，二甲双胍组和藏红花素中、高剂量组Klotho相对表达量显著升高且TGF-β1、p-Smad2相对表达量显著降低（P < 0.01）；与二甲双胍组比较，藏红花素高剂量组Klotho相对表达量显著升高且TGF-β1、p-Smad2相对表达量显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见图 3、表 3。

3 讨论

随着中医药发展战略的实施，中医药防治DN得到广大医患的关注与认可^[11]。DN在中医属于“消渴”范畴，其病机在于气阴两虚，王秀萍等^[12]研究发现，益气活血能够改善气阴两虚型临床症状，降糖调脂，对肾功能具有保护作用。藏红花为中国名贵中药材，具有活血化瘀、散郁开结之功效，其主要活性成分藏红花素具有多种生物学作用。ABOU-HANY等^[13]发现藏红花素能够提高抗氧化酶活性减轻DN大鼠氧化应激损伤，并抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路减轻DN大鼠炎症反应。Xun等^[14]和Shen等^[15]研究发现二甲双胍能够抑制肾纤维化而延缓DN进行性损伤，因此研究选择二甲双胍做为阳性对照药物。研究发现，给予二甲双胍或藏红花素治疗12周能够明显降低DN大鼠FBG水平、提高体质量，降低UPro和血清BUN、Scr水平，明显改善DN大鼠肾小球体积增大、系膜区增宽、基底膜增厚、炎性细胞浸润等病变，降低肾纤维化，并且藏红花素高剂量组效果优于二甲双胍组。

细胞应激性衰老是引发组织纤维化的重要机制，Klotho是一种在肾组织高表达的抗衰老蛋白^[16-17]。TGF-β1是一种强致纤维化因子，与肾纤维化密切相关^[18]。Huang等^[19]发现Klotho表达量降低时能够促使TGF-β1与转化生长因子受体结合，进而激活TGF-β1纤维化信号通路。高血糖诱导细胞外基质过度生成是导致组织纤维化的重要物质基础，TGF-β1能够诱导Smads磷酸化（p-Smads），p-Smads则能够诱导细胞外基质过度生成并抑制其降解^[20]，并且刘宗亮等^[21]发现抑制TGF-β/Smads信号通路能够抑制成纤维细胞增殖与分化。研究发现，给予二甲双胍或藏红花素治疗12周能够明显上调Klotho表达并下调TGF-β1、p-Smad2，并且藏红花素高剂量组调控作用优于二甲双胍组。

综上所述，藏红花素对DN大鼠肾纤维化具有抑制作用，其作用机制可能与抑制Klotho/TGF-β/Smad信号通路有关。