糖尿病是与遗传、环境、社会等因素相关的一种慢性疾病，以血糖升高为主要临床表现。随着生活水平提高及人口老龄化加剧，中国居民糖尿病发病率持续上升，其中70岁以上人群患病率达28.8%^[1]。视网膜病变是糖尿病最常见的一种微血管并发症，并发率超过30%，是糖尿病致盲的主要原因，严重影响患者生活质量^[2]。胰腺β细胞受损致使胰岛素分泌不足导致糖脂代谢紊乱，引发炎症反应，是糖尿病所致视网膜病变及其他并发症进行性加重的重要原因^[3-4]。由Toll样受体4（TLR4）及其下游蛋白核因子-κB（NF-κB）组成的信号通路在细胞炎症反应过程中发挥着关键调控作用，有研究显示，抑制TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应对糖尿病所致视网膜及心、脑、肾等组织器官并发症具有明显抑制作用^[5-8]。

糖尿病在中医可归属“消渴”范畴，其病机在于气阴两虚、脾肾阳虚、水湿潴留、瘀血痰浊内停，宜采取健脾补肾、活血化瘀、化痰降浊等方案治疗^[9-10]。银杏叶为《中国药典（一部）》收录品种，性平味甘、苦、涩，具有调中益气、健脾益肾、活血化瘀、通络止痛、化浊降脂等功效。研究表明，银杏叶提取物能够减轻早期糖尿病大鼠视网膜炎症和氧化应激损伤^[11]。临床研究发现，银杏叶提取物能够改善糖尿病视网膜病变患者血糖和血脂，提高患者视力，减轻视野缺损^[12-13]。银杏二萜内酯（GDL）为银杏叶的活性成分之一，包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K等，GDL是否对糖尿病视网膜病变具有影响尚未见报道。有研究发现，GDL能够抑制TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用^[14]。本实验通过制备糖尿病大鼠模型，研究GDL对糖尿病所致视网膜病变的影响，并基于TLR4/NF-κB信号通路探索其可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

选择100只SPF级健康雄性SD大鼠，6~7周龄，200~240 g，由天津医科大学实验动物科学部提供[SYXK（津）2019-0004]。在屏蔽环境中分笼饲养（温度23~25 ℃、湿度40%~60%、12 h光暗循环），自由饮水进食。实验动物操作严格遵循替代、减少、优化原则，实验方案通过廊坊市第四人民医院伦理委员会审批[伦理号：LFSYLL（K）2020-014]。

1.1.2 主要药物与试剂

GDL葡胺注射液（5 mL/支，GDL含量25 mg）购自江苏康缘药业股份有限公司（批号21K1009A14）；TLR4抑制剂TAK242购自美国CST公司（批号21A108F04）；链脲佐菌素（STZ）购自北京索莱宝生物科技有限公司（批号S8050）；白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒和TUNEL染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号H203-1-2、H002、H007-1-2、H008、H052-1、G001-2-1）；苏木精染色液、伊红染色液试剂盒购自北京雷根生物科技有限公司（批号DH0041、DH0045）；TLR4、NF-κB抑制因子（IκBα）、p-IκBα、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体购自英国Abcam公司（批号ab60841、ab39557、ab39562、ab56189、ab47208、ab46130）；NF-κB、p-NF-κB购自美国Affinity公司（批号AF7034、AF7059）；β-actin抗体、免疫球蛋白G（IgG）二抗、DAB显色试剂购自北京博奥森生物技术公司（批号bs-0061R、bs-0293P、D10294）；GenTeal凝胶购自美国Novartis公司（批号G20A21017）；伊文思蓝染料购自南京沃博生物科技有限公司（批号R3248）。

1.1.3 主要仪器

One Touch型动物血糖仪（美国LifeScan公司）；Synergy H1型全波长酶标仪（美国BioTek公司）；EG1140H型包埋机、RM2245型切片机（德国Leica公司）；Pac HV型电泳仪、Mini Trans-blot Cell型电转仪（美国Bio-Rad公司）；Micron IV视网膜影像系统（美国Phoenix Research Lab公司）。

1.2 方法 1.2.1 动物分组与造模

100只实验用大鼠适应性饲养1周后，随机取20只大鼠设为正常对照组（常规饲料喂养），剩余80只制备糖尿病大鼠模型：高糖高脂（基础饲料67.5%、20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇）喂养4周后30 mg/kg腹腔注射（ip）STZ，24 h、72 h后检测空腹血糖（FBG）水平，FBG≥16.7 mmol/L则可判断糖尿病大鼠造模成功；继续高脂高糖喂养12周后，荧光素血管造影检查发现眼底微血管荧光素渗漏和新生血管，则可判定糖尿病视网膜病变大鼠造模成功^[15]。共成模78只，造模成功率97.50%，将成模大鼠随机分为4组：模型组（18只）、GDL组（20只）、TAK242组（20只）、GDL+TAK242组（20只）。

1.2.2 给药

造模完成后，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”进行换算，GDL组ip给予2.3 mg/kg，TAK242组腹腔注射（ip）给予3 mg/kg^[16]，GDL+TAK242组ip给予2.3 mg/kg+3 mg/kg，正常对照组和模型组ip给予生理盐水，各组均1次/d给药治疗14 d。

1.2.3 FBG水平检测

模型组随机取9只大鼠，其他组分别随机取10只大鼠。通过尾静脉取血并通过血糖仪测定大鼠FBG水平。

1.2.4 视网膜厚度检测^[17]

ip给予40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，托品酰胺滴眼扩瞳，应用GenTeal凝胶润滑眼角膜，然后通过Micron IV视网膜影像系统进行光学相干断层扫描（OCT）检查（扫描速度10帧/s，选择距视盘沿1.5 mm的位置为测量点），每只大鼠隔30°角度测量1次，共12次，取平均值。

1.2.5 视网膜血管通透性检测

尾静脉注射45 g/L的伊文思蓝溶液（45 mg/kg），20 min后通过左心室-右心耳通路灌注200 mL浓度4%的多聚甲醛溶液，摘取眼球并分离视网膜，研碎后加入0.12 mL甲酰胺70 ℃孵育12 h，3 500 r/min离心10 min（离心半径10 cm）分离上清液，通过酶标仪检测610 nm处吸光度值，对照标准曲线计算伊文思蓝含量，伊文思蓝含量能够反映血管通透性。

1.2.6 视网膜病理改变和细胞凋亡状况观察

取模型组剩余的9只大鼠和其他组各剩余的10只大鼠。ip给予40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，颈椎脱臼处死，摘取眼球并分离视网膜，取左眼视网膜置于4%的多聚甲醛溶液固定24 h，经梯度乙醇脱水后浸蜡包埋，4 μm厚度切片、热水中展平后贴附于载玻片上，55 ℃烘烤24 h，二甲苯透明和梯度乙醇脱蜡处理后，进行常规苏木精-伊红（HE）染色（苏木精染色4 min，1%盐酸乙醇分化3 s，伊红染色4 min），梯度乙醇脱水和二甲苯透明后中性树胶封片，光镜下观察视网膜病理改变。按照试剂盒操作说明行TUNEL染色，光镜下观察视网膜细胞凋亡状况，计数视野内细胞总数和凋亡细胞数，计算凋亡指数（凋亡细胞数占细胞总数的百分比）。

1.2.7 视网膜IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量检测

取右眼视网膜，剪碎后加入9倍量4 ℃生理盐水，冰上研磨匀浆后静置20 min，3 500 r/min离心5 min（离心半径10 cm）取上清液，按照试剂盒操作说明，通过酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量。

1.2.8 Western blot法检测视网膜TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα、HMGB1、Bcl-2、Bax蛋白表达

取视网膜匀浆离心上清液，4 ℃、12 000 r/min离心25 min（离心半径8 cm）取上清液，BCA法蛋白定量，加入4倍量蛋白上样缓冲液后，以30 μg蛋白量上样，10%聚丙酰胺凝胶电泳分离蛋白、转移至PVDF膜、5%蛋白封闭液室温封闭60 min，4 ℃避光孵育TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶800）、p-NF-κB p65（1∶800）、IκBα（1∶800）、p-IκBα（1∶800）、HMGB1（1∶1 000）、Bcl-2（1∶800）、Bax（1∶800）、内参β-actin（1∶2 000）抗体稀释液过夜，TBST洗膜后室温避光孵育IgG（1∶3 000）稀释液1.5 h，TBST洗膜后DAB显色，通过Image J图像分析软件计算蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计处理，计量资料符合正态分布，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较行单因素方差分析，两两比较行LSD-t检验（方差齐时）或Dunnett’s T3检验（方差不齐时），以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠FBG水平比较

与正常对照组相比，模型组FBG水平明显升高（P < 0.05）。与模型组相比，GDL组、TAK242组和GDL+TAK242组FBG水平均明显降低（P < 0.05）。与GDL组和TAK242组相比，GDL+TAK242组FBG水平明显降低（P < 0.05）。见表 1。

2.2 各组大鼠视网膜厚度和血管通透性比较

与正常对照组相比，模型组视网膜厚度明显降低、血管通透性明显升高（P < 0.05）。与模型组相比，GDL组、TAK242组和GDL+TAK242组视网膜厚度明显升高、血管通透性明显降低（P < 0.05）。与GDL组和TAK242组相比，GDL+TAK242组视网膜厚度明显升高、血管通透性明显降低（P < 0.05）。见表 1。

2.3 各组大鼠视网膜病理改变比较

正常对照组视网膜细胞形态正常，结构完整。模型组视网膜神经节细胞层和内核层可见细胞数目减少、排列紊乱、分层不清、水肿、炎性浸润等病理改变。与模型组相比，GDL组、TAK242组和GDL+TAK242组视网膜病理改变明显减轻。与GDL组和TAK242组相比，GDL+ TAK242组视网膜病理改变明显减轻。见图 1。

2.4 各组大鼠视网膜细胞凋亡状况比较

与正常对照组相比，模型组视网膜细胞凋亡指数明显升高（P < 0.05）。与模型组相比，GDL组、TAK242组和GDL+TAK242组视网膜细胞凋亡指数明显降低（P < 0.05）。与GDL组和TAK242组相比，GDL+TAK242组视网膜细胞凋亡指数明显降低（P < 0.05）。见图 2、表 2。

2.5 各组大鼠视网膜IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量比较

与正常对照组相比，模型组视网膜IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量明显升高（P < 0.05）。与模型组相比，GDL组、TAK242组和GDL+TAK242组视网膜IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量明显降低（P < 0.05）。与GDL组和TAK242组相比，GDL+TAK242组视网膜IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量明显降低（P < 0.05）。见表 3。

2.6 各组大鼠视网膜TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα蛋白表达比较

与正常对照组相比，模型组视网膜TLR4、p-NF-κB、p-IκBα表达量及p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα比值明显升高（P < 0.05）。与模型组相比，GDL组、TAK242组和GDL+TAK242组视网膜TLR4、p-NF-κB、p-IκBα表达量及p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα比值明显降低（P < 0.05）。与GDL组和TAK242组相比，GDL+TAK242组视网膜TLR4、p-NF-κB、p-IκBα表达量及p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα比值明显降低（P < 0.05）。见图 3、表 4。

2.7 各组大鼠视网膜HMGB1、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

与正常对照组相比，模型组视网膜HMGB1、Bax表达量及Bax/Bcl-2比值明显升高，Bcl-2表达量明显降低（P < 0.05）。与模型组相比，GDL组、TAK242组和GDL+TAK242组视网膜HMGB1、Bax表达量及Bax/Bcl-2比值明显降低，Bcl-2表达量明显升高（P < 0.05）。与GDL组和TAK242组相比，GDL+TAK242组视网膜HMGB1、Bax表达量及Bax/Bcl-2比值明显降低，Bcl-2表达量明显升高（P < 0.05）。见图 4、表 5。

3 讨论

STZ对胰岛β细胞具有特异性毒性作用，可破坏胰岛β细胞导致胰岛素分泌量降低。通过高脂高糖饮食结合STZ破坏胰岛β细胞构建糖尿病视网膜病变动物模型，具有操作简便、重复率高、病理过程与人类接近等特点，是国内外普遍认可且应用最为广泛的造模方法。糖尿病视网膜病变是较常见的一种糖尿病微血管并发症，但高脂高糖耐受程度以及胰岛β细胞对STZ的敏感性存在个体差异，使糖尿病患者视网膜病变程度不同。研究中糖尿病视网膜病变大鼠造模成功率为97.50%（78/80），其中2只大鼠造模失败的原因可能与自身高脂高糖耐受程度较高和/或胰岛β细胞对STZ的敏感性较低有关。为了验证GDL对糖尿病视网膜病变的影响是否与TLR4/NF-κB信号通路有关，研究除了设置正常对照组、模型组、GDL组外，还设置了TAK242（TLR4抑制剂）组和GDL+TAK242组。

研究结果显示，糖尿病视网膜病变模型大鼠FBG水平、视网膜血管通透性升高，视网膜厚度降低，视网膜神经节细胞层和内核层呈现细胞数目减少、排列紊乱、分层不清、水肿、炎性浸润等病理改变，这与冯梅等^[18]报道一致。经GDL治疗能够明显降低糖尿病视网膜病变大鼠FBG水平和视网膜血管通透性、提高视网膜厚度，改善视网膜病变，提示GDL对糖尿病大鼠视网膜病变具有保护作用，这与柏文等^[19]分析显示银杏叶提取物能够减轻糖尿病视网膜病变大鼠视网膜病变的结果相似。

TLR4是一种跨膜识别受体蛋白，NF-κB为其下游靶蛋白。生理状态下，以“NF-κB-IκBα”复合体形成存在于胞浆中，TLR4可诱导NF-κB和IκBα磷酸化，导致“NF-κB-IκBα”复合体解离，游离态p-NF-κB核转位后其p65亚基能够与DNA特定位点结合而诱导IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子转录表达^[20]。内源性损伤分子HMGB1可促进IL-1β、TNF-α等炎症因子表达，并且HMGB1能够促进TLR4/NF-κB通路活化而进一步加重炎症反应^[21]。并且，p-NF-κB核转位后可调控Bcl-2、Bax表达而促进细胞凋亡^[22]。研究结果显示，GDL能够明显降低糖尿病视网膜病变大鼠视网膜TLR4、p-NF-κB、p-IκBα、HMGB1表达量和p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα比值，提示GDL对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜TLR4/NF-κB信号通路具有抑制作用。

GDL具有较好的抗炎活性^[23]，研究发现GDL能够明显降低糖尿病视网膜病变大鼠视网膜IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量，抑制视网膜炎症反应，减轻视网膜病理改变。这与潘艳杰等^[5]研究结果相似。持续高血糖可诱导细胞凋亡，是糖尿病视网膜病变进行性加重的重要因素。Bcl-2和Bax定位于线粒体膜，是细胞线粒体凋亡通路的重要调控蛋白^[24]。Bax能够激发线粒体膜通透性转变孔道开放有促使细胞色素C（Cyt C）进入细胞质，诱导Caspase-3活化而促进细胞凋亡；Bcl-2与Bax形成无活性的异源二聚体而失活。经GDL治疗能够降低糖尿病视网膜病变大鼠视网膜细胞凋亡指数，降低视网膜Bax、Cleaved Caspase-3表达量并提高Bcl-2表达量，降低Bax/Bcl-2比值。这与杨芳等^[25]研究结果相似。提示GDL对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜炎症反应和细胞凋亡的抑制作用可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。为了验证上述推论，本研究设置了TAK242组和GDL+TAK242组，结果显示，TAK242对糖尿病大鼠视网膜TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达以及视网膜厚度、血管通透性、视网膜病变、炎症反应、细胞凋亡的调控方向与GDL相同，GDL+TAK242组对各指标的调控作用优于TAK242组和TAK242组，进一步证实了GDL抑制糖尿病视网膜病变大鼠视网膜炎症反应和细胞凋亡的作用与抑制TLR4/NF-κB通路活化有关。

综上所述，GDL可抑制糖尿病视网膜病变大鼠视网膜炎症反应和细胞凋亡，降低视网膜血管通透性，减轻视网膜病理改变，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路活化有关。研究结果为GDL用于防治糖尿病视网膜病变提供了理论依据。课题组下一步拟开展体外细胞实验，以进一步验证GDL对糖尿病视网膜病变的影响及分子机制。