在临床上，越来越多年轻女性因为不孕、流产等疾病就诊，其主要原因是卵巢功能紊乱，下丘脑-垂体-卵巢轴（HPOA）对促卵泡生长素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平调控失调，使卵巢不能周期性的产生和排出卵泡。卵巢功能紊乱轻者会患有卵巢储备功能低下，当卵巢功能紊乱加剧，HPOA对FSH和LH的分泌水平进一步失调^[1-2]，FSH和LH的过多分泌导致卵巢中卵母细胞被过度消耗，且被招募的卵泡不能发育为优势卵泡，导致40岁以下的女性甚至会患有早发性卵巢功能不全（POI），POI可致不孕，临床自然妊娠率仅约为5%~10%，严重影响女性生殖健康。POI导致的卵巢功能紊乱及低雌激素状态（血管舒缩症状及泌尿生殖系统萎缩、骨质疏松、心血管疾病等）对患者造成严重不良影响。临床上常以40岁以下女性的月经稀发持续至少4个月或者停经至少4个月，两次血清FSH均 > 25 U/L（两次检测间隔时间应大于4周以上）为POI确诊标准。目前临床上多使用戊酸雌二醇（E2）和醋酸甲羟孕酮共同治疗POI，两种药物的用药时间不能过长，否则在治疗过程患者又会遭受如子宫内膜癌、血管栓塞性疾病等多种不良影响^[3-6]。

由明代龚廷贤《寿世保元》卷七的乌鸡丸加减而成乌鸡白凤丸，广泛用于治疗排卵期出血、青春期月经量少、围绝经期综合征、气血两虚、身体瘦弱、腰膝酸软、月经不调、带下等妇科疾病^[7-9]，疗效显著。方中用大量补肾之品滋阴壮阳，收敛固涩，如熟地黄、生地黄、山药、芡实、天门冬、桑螵蛸、牡蛎等；大量的乌鸡，辅以鳖甲、鹿角胶、鹿角霜等血肉有情之品，滋补功效更甚。此外，人参、黄芪、甘草还可补气健脾；当归、川芎、白芍、丹参尚可补血、活血，再加以香附疏肝理气，调经止痛，银柴胡清退虚热，共奏疏肝理气、补气养血、调经止带之功，与中医补肾疏肝健脾的POI治法相吻合^[10]。乌鸡白凤片是在传统中成药乌鸡白凤丸基础上，应用现代工艺生产的新型中药制剂，改善患者的依从性。因此研究提出，乌鸡白凤丸改良剂型乌鸡白凤片是否对肾精气亏虚、肝郁气滞引起的POI有治疗作用？研究拟通过：1）小鼠腹腔注射4-去氧乙烯基环已烯（VCD）复制最佳POI模型。2）并以此POI模型为基础，探究乌鸡白凤片对VCD致POI小鼠的治疗作用，为临床治疗POI提供实验室依据和思路。

1 材料与方法 1.1 实验动物

8周龄35~40 g SPF级雌性昆明小鼠120只，购自斯贝福（北京）生物科技股份有限公司[动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010]。SPF级屏障环境，室温（21±2）℃，湿度（40±10）%，光照周期12/12 h，适应性饲养14 d后用于实验。本研究经过天津中医药大学动物伦理委员会批准，伦理审查编号：TCM-LAEC2021233。

1.2 实验药物、试剂及仪器

乌鸡白凤片，天津中新药业股份有限公司乐仁堂制药厂（批号：1100254），用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液配制成低、中、高3个浓度混悬药液，4 ℃保存备用；E2购自DELPHARM Lille S.A.S.（法国，拜耳医药保健有限公司）用0.5% CMC-Na溶液配制0.3 mg/kg混悬药液，4 ℃保存备用。巴士染色液购自北京索莱宝科技有限公司；血清FSH、LH酶联免疫试剂盒购自武汉云克隆股份有限公司；VCD购自Sigma公司；芝麻油购自上海源叶生物科技有限公司；4%多聚甲醛购自biosharp；苏木精-伊红（HE）染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。多功能酶标仪：TECAN INFINITE F50；光学显微镜：Nikon Y-FL；离心机：Thermo Fisher Sorvall Legend Micro 21R（离心半径为8.6 cm）；电子天平：常州万泰天平仪器有限公司（ZN1004HM）。

1.3 实验方法 1.3.1 POI小鼠模型的建立

60只SPF级昆明小鼠自由饮水饮食，适应性饲养14 d。将小鼠随机分为正常（CON）组30只，模型（MOD）组30只。POI小鼠模型的制备参照文献^[11-12]稍做调整，MOD组腹腔注射160 mg/（kg·d）VCD，CON组小鼠腹腔注射同体积芝麻油，每日1次，连续15 d。自腹腔注射VCD开始，每日阴道涂片观察小鼠动情周期；第15天开始，每5 d选择动情期小鼠进行眼眶取血0.5 mL，动态观察血清FSH、LH的水平；第45天开始，每5 d选择动情期小鼠处死，快速取出双侧子宫、卵巢称质量，并计算脏器指数，一侧卵巢置于4%多聚甲醛中固定。MOD组随腹腔注射VCD时间延长，小鼠动情周期全部紊乱，故MOD组后期采用随机抓取的方式。脏器指数=（脏器湿质量/体质量）×100%。

1.3.2 乌鸡白凤片灌胃给药

将60只昆明小鼠随机分为CON组、MOD组、E2组、乌鸡白凤片低、中、高剂量组，每组各10只。腹腔注射160 mg/（kg·d）VCD 15 d，观察40 d，总计造模55 d制备POI小鼠模型。第56天开始灌胃给药不同剂量乌鸡白凤片或阳性药E2，灌胃体积为每只0.16 mL。CON组、MOD组灌胃给予同体积溶媒0.5% CMC-Na，每只0.16 mL，共给药45 d。于给药第46天，采集各组小鼠血液，观察血清FSH、LH的水平。处死小鼠后快速取出双侧子宫、卵巢，用电子天平称取双侧子宫和卵巢湿质量后计算脏器指数，一侧卵巢置于4%多聚甲醛中固定。

1.3.3 阴道涂片观察小鼠动情周期

每日小鼠阴道脱落细胞涂片观察动情周期。用移液枪吸取20 μL生理盐水，轻柔插入小鼠阴道慢慢冲洗5次后，涂抹在黏附载玻片上，自然晾干后采用巴士染色法：95%乙醇固定细胞，梯度乙醇脱水。苏木精染细胞核，盐酸乙醇分化液浸泡洗去细胞质中苏木素。自来水冲洗后蓝化液返蓝，自来水再次冲洗。巴士染色液染色，经95%乙醇冲洗、无水乙醇脱水后，在光学显微镜下进行观察，并计算各组小鼠动情周期紊乱率。小鼠动情周期紊乱评判标准为：小鼠发情周期杂乱无章，或停滞于某个阶段，则认为该小鼠动情周期紊乱。

动情周期紊乱率=动情周期紊乱只数/每组总只数×100%。

临床上，以女性月经稀发持续或停经至少4个月为POI的诊断标准之一。因为小鼠的动情周期为5 d，故研究将小鼠至少有4次动情周期紊乱作为小鼠POI模型判定标准之一。

1.3.4 酶联免疫吸附（ELISA）法检测小鼠血清FSH、LH的水平

取血结束静置30 min，4 ℃，10 000×g离心20 min，取上清液。按照ELISA试剂盒说明书要求，向包被抗体的微孔中加入生物素标记的抗原和待测抗原（标准品或样本），待测抗原与生物素标记抗原对特异性抗体进行竞争结合，37 ℃孵育1 h后经洗涤去掉未结合物，然后加入过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，37 ℃孵育30 min彻底洗涤后加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB）显色，加入终止液，酶标仪450 nm处检测吸光度。临床上POI的诊断的另一标准为两次血清FSH均 > 25 U/L（两次检测间隔时间应大于4周以上），研究同时采用两次血清FSH均显著升高作为小鼠POI模型判定的另一标准。

1.3.5 卵巢病理学观察

所取卵巢组织于4%多聚甲醛固定24 h以上，将固定好的组织修剪成合适大小后，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后用石蜡包埋、切片，在40 ℃温水中展片后贴于载玻片上，放入60 ℃烘箱中烘干。用二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，苏木精染细胞核，伊红染细胞质后再用梯度乙醇、二甲苯脱水，中性树胶封片，于光学显微镜下观察卵巢的组织学形态。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件统计分析数据，服从正态分布的实验数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），多组间多重比较方差齐时采用LSD法，不齐时采用Dunnett’s T3法。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 腹腔注射VCD后不同时间小鼠一般状态和动情周期观察

VCD造模过程中，CON组小鼠活动正常，皮毛光滑，排便及精神状态良好，反应灵敏，体质量稳定增长。MOD组小鼠腹腔注射VCD后，排便和毛色未见有明显变化，但情绪暴躁，易激惹，体质量虽增长但始终低于CON组小鼠。见图 1。

正常小鼠的动情周期一般为4~5 d，从图 1阴道涂片可以看出，CON组小鼠动情前期多为有核上皮细胞，动情期为大量的角质化无核上皮细胞；动情后期则表现为角质化无核上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞3种细胞同时存在；进入动情间期后，白细胞占大多数，有核上皮和角质化上皮细胞少见。见图 2。正常情况下，小鼠动情周期按照动情前期，动情期，动情后期，动情间期4个阶段有序进行，构成一个完整的动情周期。

如小鼠发情周期杂乱无章，或停滞于某个阶段，则认为该小鼠动情周期紊乱。从图 2也可以看出，MOD组小鼠动情周期紊乱，常表现为无动情周期或动情周期延长。根据每日阴道涂片结果统计小鼠动情紊乱率，CON组从0~65 d，小鼠无动情紊乱。与CON组相比，MOD组小鼠在造模35 d时动情周期紊乱率达50%以上，45 d开始紊乱率达到100%，并持续至造模65 d。MOD组小鼠动情周期在第60、65天，动情周期紊乱状态达4个周期以上。见图 3。

2.2 腹腔注射VCD后不同时间小鼠血清FSH、LH的变化

研究采集了VCD造模第15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65天的血清样本，ELISA法检测血清FSH、LH水平。与CON组相比，自造模第35天，MOD组小鼠血清FSH呈上升趋势，第50、55、60、65天，血清FSH极显著升高（P < 0.01）；自造模第30天，MOD组小鼠血清LH呈上升趋势，第55天开始LH升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）。

结合POI临床诊断标准，VCD造模55 d后小鼠动情周期已持续紊乱4个周期，血清FSH显著升高2次。故研究认为小鼠腹腔注射160 mg/（kg·d）VCD 15 d后观察40 d，总计造模55 d，可制备POI小鼠模型。见图 4。

2.3 腹腔注射VCD后不同时间小鼠卵巢、子宫湿质量及脏器指数的变化

研究同时于第45、50、55、60、65天，处死CON组、MOD组小鼠各3只，称取小鼠子宫、卵巢湿质量，并计算脏器指数。与CON组相比，VCD造模55 d，MOD组小鼠子宫、卵巢湿质量及脏器指数下降，差异具有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01）。见图 5。

2.4 腹腔注射VCD对小鼠卵巢形态的影响

VCD造模55 d时，CON组小鼠卵巢结构清晰，原始卵泡、生长卵泡（初级卵泡和次级卵泡）和窦状卵泡数目较多，MOD组小鼠卵巢偏实质化，未见有原始卵泡和生长卵泡，见图 6。对卵巢中各级卵泡数目进行统计，VCD造模第55天，与CON组相比，MOD组小鼠卵巢中各级数量均降低，差异具有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01）。见图 7。

2.5 乌鸡白凤片灌胃给药45 d对小鼠动情周期的影响

POI小鼠造模成功，乌鸡白凤片灌胃给药45 d后，阴道涂片观察显示，CON组小鼠动情周期正常，其余各组小鼠动情周期紊乱，表现为周期延长或无明显周期，经乌鸡白凤片干预后，各剂量组小鼠动情周期逐渐恢复，见图 8。乌鸡白凤片低剂量组小鼠有9只动情周期恢复正常，1只动情周期延长；乌鸡白凤片中、高剂量组小鼠动情周期均已恢复正常，且乌鸡白凤片对POI小鼠动情周期紊乱的改善作用优于E2组。见表 1。

2.6 乌鸡白凤片灌胃给药45 d对POI小鼠血清FSH、LH水平的影响

与CON组相比，MOD组小鼠血清FSH、LH水平升高，差异具有统计学意义（P < 0.01，P < 0.001）。与MOD组相比，给药治疗45 d后，乌鸡白凤片各剂量组小鼠血清FSH、LH呈剂量依赖性降低，差异具有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001），乌鸡白凤片中、高剂量组对POI小鼠FSH、LH水平异常升高的调控作用均优于E2。见图 9。

以上结果表明乌鸡白凤片可以显著降低POI小鼠血清FSH、LH水平，其作用可能是通过改善HPOA腺垂体对FSH、LH水平的分泌，改善POI小鼠的卵巢功能，促进卵泡正常发育为优势卵泡实现。

2.7 乌鸡白凤片灌胃给药45 d对POI小鼠子宫、卵巢湿质量及指数的影响

与CON组相比，MOD组小鼠子宫湿质量、子宫指数下降，差异具有统计学意义（P < 0.05）；经乌鸡白凤片治疗45 d，与MOD组相比，乌鸡白凤中、高剂量组小鼠子宫湿质量、子宫指数升高，差异具有统计学意义（P < 0.05，P < 0.001）。同样，MOD组小鼠卵巢湿质量和卵巢指数低于CON组，差异具有统计学意义（P < 0.001），而乌鸡白凤中、高剂量组小鼠的卵巢湿质量和卵巢指数显著升高，差异具有统计学意义（P < 0.05，P < 0.001）。见图 10。

2.8 乌鸡白凤片灌胃给药45 d对POI小鼠卵巢形态的影响

光学显微镜下观察发现，CON组卵巢结构正常，卵巢中可见发育良好的生长卵泡和窦状卵泡，黄体组织结构完整；MOD组卵巢发育较差，未发现生长卵泡、窦状卵泡。乌鸡白凤片给药治疗后，各剂量组卵巢中原始卵泡、生长卵泡数量增加，可见窦状卵泡和结构完整的黄体组织，见图 11。

与CON组相比，MOD组各级卵泡数量减少，差异具有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）。与MOD组相比，乌鸡白凤片中、高剂量组小鼠原始卵泡数量增加，差异具有统计学意义（P < 0.05）；乌鸡白凤片低剂量组小鼠初级卵泡数量极增加，差异具有统计学意义（P < 0.01），证明乌鸡白凤片具有促进POI小鼠卵泡发育的作用，提示乌鸡白凤片具有治疗POI的作用。见图 12。

3 讨论

西医认为，月经是子宫周期性出血的一种生理现象，主要由HPOA调控，下丘脑作用于腺垂体，促使其分泌的FSH和LH作用于卵巢。在月经周期的前期，FSH、LH促进卵泡生长发育，并将卵巢内膜分泌的雄激素转化为雌激素。在FSH的作用下，被招募的卵泡中其中一个卵泡由于富含FSH受体且FSH阈值较低，成长为优势卵泡，再经LH分泌高峰的诱发下成为成熟卵泡排卵，排卵后的卵泡萎缩形成黄体，子宫内膜在黄体细胞分泌的雌、孕等激素的作用下逐渐增厚，此时雌激素负反馈作用于HPOA，减少FSH、LH分泌水平。在月经周期的后期，黄体萎缩，子宫内膜失去雌、孕等激素的支持，逐渐脱落，月经来潮^[13]。由于POI患者卵巢功能受损，卵泡分泌雌激素能力降低，对HPOA的负反馈作用消失，导致FSH、LH水平在患者体内异常升高，卵泡被不断的招募、消耗，使得卵巢中剩余卵母细胞数量比正常女性少，同时被招募的卵泡由于FSH阈值较高，卵泡不能在FSH、LH促进下正常生长发育为优势卵泡^[14]，导致患者月经稀发或停经。本研究在此基础上，采用VCD诱导POI小鼠模型，监测小鼠FSH、LH血清水平和卵巢形态学变化，验证VCD对小鼠卵巢功能的损伤，并探究乌鸡白凤片通过调节FSH、LH水平，改善紊乱的HPOA，保护原始卵泡，促进卵泡发育，对抗VCD造成的卵巢功能损伤，使多数卵巢功能衰退的女性月经周期恢复正常^[15]。

在实验研究中，POI动物模型的建立方法多样，主要依据其发病原因的不同而采用不同的病理方法来进行模型制备。总体评价而言，目前化疗药物、自身免疫方法以及卵巢毒性物质VCD，为较为公认的POI造模方法。其中，化疗药物会给实验动物带来感染其他疾病的风险，增加实验动物的死亡率；自身免疫性POI模型耗时较长，成功率低，故应用不广泛。相较于以上两组造模方法，卵巢毒性物质VCD不仅能动态模拟卵巢衰退的不同阶段，还在诱导FSH、LH分泌水平的变化与人类卵巢衰退的性激素的变化非常接近，同时还会引起动物行为的改变，例如焦虑、抑郁和攻击性等POI患者常出现的异常状态，且VCD对性腺以外的器官几乎无影响。故本研究采用VCD制备POI小鼠模型^[16-17]。

VCD是工业上用作二环氧化物和环乙烯树脂稀释剂的4-乙烯基环己烯（VCH）的主要代谢产物之一。研究表明VCD通过攻击原始卵泡和初级卵泡，影响卵巢中雌激素的分泌，导致患者出现月经不调、流产等POI相关病症^[11]。不同文献对于160 mg/（kg·d）VCD注射后判定POI模型成功观察的时间并不统一，如Hoyer报道注射后观察59 d，Romero-Aleshire报道注射后观察0 d。另外还有Cao等报道的VCD的注射剂量为80 mg/（kg·d），不同在研究采用的VCD制备POI动物模型的时间和剂量都不尽相同^{[12, 18-19]}。研究结果显示，腹腔注射160 mg/（kg·d）VCD 15 d后，观察40 d，总计VCD造模55 d时小鼠HPOA功能紊乱，腺垂体对FSH、LH水平调控失调，FSH、LH水平异常升高，各级卵泡数量显著性下降，小鼠动情周期紊乱，与?魻zel等^[20]报道的大鼠腹腔注射80 mg/（kg·d）VCD结果相一致，故后续实验采用腹腔注射160 mg/（kg·d）VCD 15 d后，观察40 d，总计VCD造模55 d，制备POI小鼠模型。

研究结果表明，乌鸡白凤片灌胃给药45 d对VCD致POI小鼠的动情周期具有较显著的调节作用，可通过显著下调POI小鼠HPOA腺垂体分泌FSH、LH水平，促进卵泡正常发育，改善小鼠动情周期，促进小鼠卵巢功能恢复，与邱勇飞等^[21]、宋翠淼等^[22]报道结果相一致。此外，乌鸡白凤片中、高剂量组对POI小鼠的动情周期紊乱和FSH、LH水平异常升高的改善效果优于E2组，能够较好的改善HPOA功能，且在给药期间小鼠未表现出不良反应，有利于提高临床治疗率和患者的依从性。

综上所述，腹腔注射160 mg/（kg·d天）VCD 15 d后，观察40 d，总计VCD造模55 d，可制备POI小鼠模型。乌鸡白凤片灌胃给药45 d后，可通过影响POI小鼠HPOA腺垂体分泌FSH、LH水平，保护原始卵泡并促进卵泡发育，调节POI小鼠动情周期，显著改善VCD所致小鼠POI病症。研究结合临床POI诊断标准，报道了VCD所致小鼠POI模型的动态过程，为后续POI实验动物模型的研究提供了研究基础。同时研究为乌鸡白凤片临床治疗POI提供了实验室依据。