糖尿病慢性并发症已成为糖尿病致死、致残的主要原因^[1]。糖尿病是一种胰岛素抵抗和血糖升高为特征的代谢紊乱性疾病^[2]。持续高血糖及胰岛素抵抗造成脂代谢紊乱及脂质在肝脏积聚增多^[3-4]，而肝脏是糖类代谢的重要器官，长期慢性血糖升高超过肝脏清除能力时，引起氧化应激和炎性细胞因子分泌异常，进而导致糖尿病肝功能受损^[5]。糖尿病肝损伤的发病机制尚不明确，目前治疗主要是基于糖尿病或者肝损伤本身，临床治疗肝损伤的药物虽有一定疗效，但此类药不良反应较多，尚无专门针对糖尿病肝损伤的特效药^[6]。因而，探寻治疗糖尿病肝功能受损的药物具有一定意义。

中医肝络学说指出肝病的病理因素是“湿-毒-瘀-虚”，核心病机为肝络瘀阻、瘀血阻滞、痰浊凝滞、气阴两虚和湿毒内蕴^[7]，依据病因病机可采用益气活血、活血化瘀、滋阴养血、化痰活血、解毒通络等治法。芪参益气滴丸具有补气、活血、化瘀的功效，是益气活血法的代表方药，广泛用于心血管病的治疗。研究发现，芪参益气滴丸还能明显改善肝纤维化患者的临床疗效，减轻大鼠肝脏病变和肝纤维化损伤程度^[8-9]。但目前关于芪参益气滴丸对糖尿病肝损伤的作用及机制鲜有报道。本研究旨在通过高脂饮食联合链脲霉素诱导糖尿病模型，探讨芪参益气滴丸对糖尿病小鼠肝损伤的效应靶点。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

60%脂肪供能高脂饲料（H10060）购自北京华阜康生物科技股份有限公司。血糖仪、血糖试纸购自德国Roche公司。总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。链脲霉素（Streptozocin）购自美国Sigma-aldrich试剂公司。改良油红O染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。芪参益气滴丸购自天士力制药集团股份有限公司。EX-527购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。鼠源Sirt1抗体（货号：sc74465）、鼠源PGC-1α抗体（货号：sc518038）购自美国Santa公司。兔源AMPKα抗体（货号：2532S）、兔源磷酸化AMPKα（p-AMPKα）抗体（货号：2535S）购自美国CST公司。鼠源β-actin抗体（货号：GB12001）购自武汉塞维尔生物科技有限公司。Synergy H1型多功能微孔板检测仪购自美国BioTek公司。5424R高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。Bx5型正置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 实验动物

80只健康SPF级雄性C57BL/6J小鼠，6~8周龄，体质量17~20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2021-0006。动物实验由北京中医药大学东方医院实验动物使用与管理委员会批准（伦理批号：DFYY202225M）。

1.3 实验分组及模型建立

80只雄性小鼠，采用随机数字表法选取12只为对照组，14只为模型组，18只为芪参益气滴丸低剂量组（每日灌胃227.5 mg/kg，以下简称低剂量组），18只为芪参益气滴丸高剂量组（每日灌胃455 mg/kg，以下简称高剂量组），18只为EX-527抑制剂组（芪参益气滴丸低剂量每日227.5 mg/kg+EX-527 10 mg/kg，腹腔注射3 d，以下简称抑制剂组），EX-527为Sirt1的选择性抑制剂。小鼠适应性饲养1周，第2周开始除对照组继续喂养正常饲料外，其余4组均喂养高脂饲料至实验结束，第3周后模型组、芪参益气滴丸给药组、EX-527抑制剂组腹腔注射链脲霉素每日50 mg/kg，连续注射7 d，对照组腹腔注射等剂量生理盐水。10 d后，采用血糖仪检测小鼠空腹血糖值均 > 11.1 mmol/L，即为糖尿病小鼠，见表 1。4周后，随机选取5只糖尿病小鼠观察肝脏病理变化和肝功能参数，确定为糖尿病肝损伤^[10-11]。第5周予低、高剂量和EX-527抑制剂干预2周后取材，注射链脲霉素后模型组死亡1只小鼠。

1.4 血清AST、ALT、TC、TG检测

收集血液静置后，于4 ℃离心15 min，转速3 500 r，离心半径8.4 cm，取上清，依据试剂盒说明书步骤测定各组小鼠血清中AST、ALT、TC、TG水平。

1.5 肝脏病理染色

实验结束后摘眼球取血，迅速摘取肝脏，将肝脏置于4%中性多聚甲醛固定液，进行组织脱水、包埋、切片。每组小鼠肝脏进行苏木精-伊红（HE）染色、Masson染色，每组选取6个切片进行油红O染色，中性树胶封片，显微镜下观察肝脏病理结构变化、胶原纤维沉积及肝脂肪变性情况。采用Image-Pro Plus软件半定量分析肝脏纤维面积比值。

1.6 肝脏TUNEL染色

每组选取6个小鼠肝脏组织进行TUNEL染色，观察各组小鼠肝细胞凋亡变化。将固定好的组织切片与蛋白酶K孵育15~30 min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤3次。将切片与TdT酶反应液在37 ℃避光孵育1 h，然后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体孵育30 min。DAB显色，苏木精复染核。于显微镜下随机选取10个视野，采用Image-Pro Plus软件统计棕褐色细胞核的面积比值。

1.7 肝脏Sirt1、AMPKα、p-AMPKα和PGC-1α蛋白表达检测

取肝脏组织裂解、提取蛋白，BCA测试盒定量蛋白浓度。蛋白裂解物在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上分离并转膜。采用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，4 ℃冰箱孵育Sirt1、AMPK、p-AMPKα、PGC-1α和β-actin抗体过夜，次日TBST洗膜，室温孵育二抗1 h。化学发光成像系统检测蛋白条带，采用Quantity One软件统计相对蛋白灰度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。各组数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 芪参益气滴丸对糖尿病肝损伤小鼠肝功能的影响

由于小鼠血清量较少，未能每只都进行肝功能参数检测，每组选取8只。与对照组比较，模型组小鼠血清的ALT、TC、TG含量均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，低、高剂量组的ALT、TC、TG均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。与低剂量组相比，抑制剂组小鼠肝功能指标差异无统计学意义（P > 0.05）。各组之间的AST差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

2.2 芪参益气滴丸对糖尿病肝损伤小鼠肝脏结构的影响

对照组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞呈放射状排列规则，未见变性和坏死。与对照组比较，模型组小鼠肝细胞肿胀，肝小叶结构紊乱，细胞核深染、固缩，局部有炎症细胞浸润。低、高剂量组的肝脏病理变化得到一定程度改善。与低剂量组相比，抑制剂组肝小叶结构不清，细胞核萎缩、深染，局部可见炎性细胞浸润。见图 1。

2.3 芪参益气滴丸对糖尿病肝损伤小鼠肝脂肪变性的影响

与对照组相比，模型组小鼠肝细胞内可见大量红色脂肪滴，呈显著脂肪变性。与模型组比较，低、高剂量组红色脂肪滴明显减少，脂肪轻度变性。与低剂量组比较，抑制剂组的脂肪滴无明显差异。见图 2。

2.4 芪参益气滴丸对糖尿病肝损伤小鼠肝脏胶原纤维的影响

与对照组比较，模型组小鼠的蓝色胶原纤维沉积显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，低剂量组和高剂量组小鼠胶原纤维含量明显减少（P＜0.01）。与低剂量组比较，抑制剂组的胶原纤维化水平显著增加（P＜0.01）。见图 3。

2.5 芪参益气滴丸对糖尿病肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响

与对照组比较，模型组小鼠中棕褐色肝细胞凋亡数目明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，低剂量组和高剂量组肝细胞凋亡数量明显减少（P＜0.01）。与低剂量组相比，EX-527抑制剂组的肝细胞凋亡数目显著增加（P＜0.01）。见图 4。

2.6 芪参益气滴丸对糖尿病肝损伤小鼠肝脏蛋白表达的影响

综合以上结果，小鼠低剂量组效果更好，所以选取低剂量组进行蛋白检测。与对照组相比，模型组小鼠肝脏中Sirt1和PGC-1α的表达明显增加（P < 0.05或P < 0.01），p-AMPKα/AMPKα水平明显降低（P < 0.01）。与模型组比较，低剂量组肝脏的Sirt1和p-AMPKα/AMPKα含量显著增加（P < 0.05或P < 0.01），PGC-1α表达显著降低（P < 0.01）。与低剂量组比较，抑制剂组的Sirt1表达降低，PGC-1α水平明显提升（P < 0.01），p-AMPKα/AMPKα水平差异无统计学意义。见图 5。

3 讨论

糖尿病是脂肪肝的高危因素，糖尿病合并脂肪肝使肝脏中的脂肪沉积加重，增加微血管、大血管并发症几率，患者死亡风险增加^[12]。糖尿病肝损伤主要表现为肝功能障碍和肝脏病理结构改变^[13]。中医认为“瘀，热，毒，湿，痰，虚”是糖尿病肝病的发病原因。因此，活血化瘀法、益气养阴法是治疗糖尿病肝损伤的主要方向。本研究结果提示，芪参益气滴丸可以降低肝功能损伤，减轻肝脏炎性病变，抑制肝纤维化和肝细胞凋亡，而Sirt1抑制剂EX-527能部分抑制芪参益气滴丸的治疗作用，说明芪参益气滴丸改善糖尿病肝损伤的作用可能与Sirt1信号有关。

AST、ALT、TC、TG是评价肝功能损伤的敏感指标，当肝细胞和线粒体损伤，AST、ALT释放入血，使血清中AST、ALT含量显著升高，提示肝功能严重受损^[14]。如果机体摄入过多脂肪，超量的脂肪会在肝脏转化、生成TC和TG，大量TG堆积于肝脏会导致肝功能障碍^[15]。本研究显示，芪参益气滴丸明显降低糖尿病小鼠血清中AST、ALT、TC和TG水平，从而改善小鼠肝功能损伤，加入EX-527可以抑制芪参益气滴丸的作用。

肝脏脂肪变性主要是由于缺血、缺氧、中毒和感染等因素引起肝内细胞脂肪代谢失衡，导致胞内脂质累积^[16]。轻微肝脂肪变性造成的损伤是可逆的，消除病因可恢复。严重肝脏脂肪变性，会导致胶原纤维化增生、肝细胞坏死、肝硬化和肝功能衰竭^[17]。因此，抗肝细胞凋亡、逆转肝纤维化和肝脂肪变性、抑制脂代谢异常是治疗糖尿病肝损伤的重要方向。本实验结果显示，芪参益气滴丸能抑制糖尿病小鼠肝细胞凋亡和肝纤维化，降低肝脏脂肪变性程度，减轻脂质代谢紊乱，维持肝细胞结构完整。

Sirt1介导众多心血管效应，在细胞核，Sirt1与多转录因子相互作用，抑制核因子-κB（NF-κB）信号传导和促炎细胞因子表达。此外，Sirt1减少血浆Pcsk9水平，增加肝脏低密度脂蛋白胆固醇受体密度，进而降低血浆低密度脂脂蛋白胆固醇水平。AMPK参与维持细胞内能量平衡和脂质氧化代谢。线粒体毒素、缺氧条件、葡萄糖缺乏和运动均会导致AMPK激活，AMPK激活后重新连接代谢以减少合成代谢（即ATP消耗）和增加分解代谢（即ATP生产），恢复有利的能量平衡^[18-19]。PGC-1α调控线粒体生成，是ATP合成调节的转录辅因子。研究发现，PGC-1α可与多种核激素受体及转录因子相互作用，介导相关基因转录激活，参与糖代谢、脂代谢和能量代谢^[20]。本研究结果表明，芪参益气滴丸能上调肝组织Sirt1、AMPK表达，同时下调PGC-1ɑ含量。相反，Sirt1抑制剂则逆转芪参益气滴丸的作用，说明芪参益气滴丸改善糖尿病小鼠肝功能受损可能与Sirt1/AMPK/PGC-1α信号有关。

综上，芪参益气滴丸可能通过激活Sirt1/AMPK/PGC-1α信号，抑制糖尿病小鼠肝脏结构病变和纤维化增生，减轻肝脂肪变性和肝细胞凋亡，促进糖尿病肝功能修复。本研究初步证实了芪参益气滴丸改善糖尿病肝损伤的可能机制，为中医药防治糖尿病肝病提供实验依据。