天津中医药  2023, Vol. 40 Issue (8): 1052-1058 |
西北燥证是以新疆为代表的西北地区，受到燥邪侵袭，从而表现出口鼻、咽喉、肌肤干燥和干咳、烦躁等症状的一组中医证候。该组证候是新疆地区人群亚健康状态的特征性表现。可影响过敏性鼻炎、咽炎、支气管炎、皮肤瘙痒等多种疾病[1]。
慢性支气管炎(CB)属于慢性非特异性炎症，其病位在气管、支气管黏膜及周围组织。作为一种临床诊断，主要以慢性咳嗽、咳痰为特征。CB发生发展的首要病因是吸烟，其次为粉尘、烟雾、有害气体的吸入等[2]。细菌和病毒的感染也是发病的重要因素之一。在临床方面，主要依据患者的情况，分期进行治疗。同时，中医药也发挥了很大的作用，方剂、针刺、贴敷等有较好疗效[3]。
中医学将慢性支气管炎归属于“咳嗽”等范畴。“咳嗽”首先记载于《黄帝内经》，并指出病位在肺[4]。桑麻止咳汤是全国名中医周铭心治疗慢性支气管炎的临床经验方，临床疗效显著。桑麻止咳汤由桑白皮、炙麻黄、黄芩、鱼腥草、前胡、川贝母(伊贝母)、紫菀、款冬花、炙甘草9味药组成。慢性支气管炎以肺失宣肃为主要证候。凡肺气宣肃不利，势必停痰而郁热。故其治疗要在宣肃肺气，清热化痰，务使肺体清虚。该方即以此宗旨而设。方委麻黄为君，以其能宣能肃，最为肺家主将。用桑白皮、前胡，或宣或肃，俱善梳理肺气，故以为臣；复用黄芩、鱼腥草以清肺中热邪郁火，伊贝母、紫苑、款冬花以化其痰浊蕴结，并为佐药；后用炙甘草，既可祛痰止咳而为佐，又能调和药性而为使。诸药合和，使肺体清爽，气得宣降，旧宿之邪从而驱除，欲侵之邪无由而入，则其病乃愈。临证时依据病症不同，取上述方药为主而做适当加减。咳嗽痰白，而兼恶寒无汗，鼻塞清涕者，加羌活、苏叶、白芷；咳嗽痰黄，而兼发热口渴，苔黄脉数者，加桑叶、生石膏、知母；咳嗽痰多，而兼胸脘满闷，苔白腻者，加半夏、陈皮、茯苓。至于兼有肝火从证者，加青黛(布包)、栀子，兼有阴虚从证者，加沙参、百合。
韩荣等[5]研究发现，运用西北燥证经验方药治疗携证型慢性支气管炎，不仅对西北燥证有较好改善，而且对慢性支气管炎病情改善也优于普通治疗。基于桑麻止咳汤治疗西北燥证兼CB的临床疗效，故该研究利用网络药理学和分子对接技术探讨桑麻止咳汤治疗西北燥证兼CB的作用机制，为进一步的深入研究提供依据。
1 资料与方法 1.1 中药成分及靶点信息收集在本草组鉴(HERB)数据库(http://herb.ac.cn/)中检索桑白皮，炙麻黄，黄芩，鱼腥草，前胡，川贝母，紫菀，款冬花，炙甘草，收集其化学成分，在Pubchem数据库(https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/)检索其化学结构，将化学结构导入SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch/)预测成分的化学性质，对所有成分进行筛选，活性成分需同时满足以下条件：1)胃肠吸收(GI absorption)为“High”。2) 5种类药性预测(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)结果中有2个及2个以上为“Yes”。活性成分的靶点通过SwissTargetPrediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)获取，设置物种为“homo sapiens”，筛选条件为Probability＞0。
1.2 疾病靶点筛选以“Chronic Bronchitis”为关键词，在GeneCards(https://www.genecards.org/)中进行检索，以Relevance score > 1为筛选标准。
1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，得到交集靶点，作为药物治疗疾病的预测靶点进行通路富集分析。将交集靶点提交至STRING(https://string-db.org)数据库，生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“high confidence”(> 0.7)并剔除游离的靶点，再导出数据通过Cytoscape 3.7.1构建PPI网络模型并进行网络拓扑分析。PPI网络中，节点代表靶基因，连线代表靶基因之间相互作用；节点越大表示靶点在PPI网络中的Degree值越大，颜色由冷色到暖色渐变表示Degree值由小到大。
1.4 基因本体(GO)生物学过程和京都基因与基因组百科(KEGG)信号通路富集分析将交集靶点运用生物学信息注释数据库(DAVID)进行GO生物学过程分析，以P < 0.05和Benjamin值< 0.05为筛选标准。GO富集分析包括生物学程(BP)，细胞成分(CC)和分子功能(MF)3个方面。将交集靶点运用生物学信息注释数据库(DAVID)进行京都基因与KEGG信号通路富集分析，以P < 0.05和Benjamin值< 0.05为筛选标准，并对数据进行可视化处理。
1.5 中药-成分-疾病靶点网络构建为了更好的理解中药、成分与其相应靶点之间的复杂相互作用关系，将中药复方、中药、中药成分、治疗疾病以及作用靶点构建方剂-中药-成分-靶点-疾病网络图。
1.6 分子对接通过TCMSP数据库及PubChem数据库得到桑麻止咳汤成分的3D结构信息，同时通过PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载靶蛋白的3D结构，使用AutodockTools 1.5.7软件分别对小分子和靶蛋白进行加氢、去电荷等前处理，借助PyMOL 2.5.2软件插件找到对接活性位点，即可在Autodock Vina 1.2.0软件将处理后的成分与靶蛋白进行分子对接，最后通过PyMOL 2.5.2软件将对接结果进行可视化。
2 结果 2.1 桑麻止咳汤有效成分和靶点信息经过检索和汇总，桑白皮获得72个化学成分，657个靶点；炙麻黄获得6个化学成分，165个靶点；黄芩获得68个化学成分，566个靶点；鱼腥草获得14个化学成分，342个靶点；前胡获得45个化学成分，660个靶点；川贝母获得62个化学成分，714个靶点；紫菀获得23个化学成分，465个靶点；款冬花获得32个化学成分，557个靶点；炙甘草获得5个化学成分，226个靶点。将所有靶点删重汇总后得到287个药物成分，1 147个药物靶点。
2.2 慢性支气管炎靶点预测结果在GeneCards数据库中得到CB相关靶点213个。
2.3 PPI网络分析通过Venny 2.1.0平台得到桑麻止咳汤与CB的交集靶点117个，见图 1。
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| 图 1 桑麻止咳汤和CB的交集靶点 Fig. 1 Intersection target of Sangma Zhike Decoction and CB |
PPI网络图见图 2。此网络共包含44个节点，147条边，Degree值大于10的蛋白靶点有10个，它们分别是：TNF(degree值为20)、CXCL8(20)、IL1B(19)、IL6(17)、CCL2(16)、MMP9(16)、ALB(13)、VEGFA(13)、TLR4(11)、MMP1(11)。说明这些靶点在治疗CB中存在重要作用。
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| 图 2 PPI网络图及靶点degree值可视化 Fig. 2 PPI network diagram and visualization of target degree values |
GO富集分析总共富集到66条BP，11项MF相关，16项CC相关。利用生物信息学平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化分析，选取靶点Count值≥7的富集结果进行展示，如图 3。结果显示，桑麻止咳汤治疗CB在生物过程中，主要包括RNA聚合酶Il启动子的转录调控，免疫反应，炎症反应；细胞组成主要包括细胞外间隙，质膜，细胞表面等；分子功能包括同一蛋白质结合，内肽酶活性等。
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| 图 3 GO富集分析 Fig. 3 GO enrichment analysis |
KEGG总共富集到49条信号通路。利用生物信息学平台进行可视化分析，选取靶点Count值排名靠前的20条通路进行展示。见图 4。主要包括IL-17信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用信号通路和AGE-RAGE信号通路等。
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| 图 4 KEGG富集分析 Fig. 4 KEGG enrichment analysis |
中药-成分-疾病靶点网络构建结果见图 5，degree值排名靠前的成分有quercetin(槲皮素degree值为505)、palmitic acid(棕榈酸：484)、kaempferol(山奈酚：404)、myristic acid(肉豆蔻酸：257)、methyl palmitate(棕榈酸甲酯：252)、apigenin(芹菜素：202)；degree值排名靠前的靶点有CA1(degree值为181)、CA2(178)、CYP19A1(164)、ESR2(136)、CA4(135)、CA12(134)、ACHE(131)、CA9(121)、CA7(114)、AR(113)、ESR1(109)、EGFR(106)、ALOX5(105)、PTGS2(103)、MAOA(101)。
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| 图 5 中药-成分-疾病靶点网络图 Fig. 5 Traditional Chinese medicine-component-disease target network diagram |
将6种核心潜在化合物与10个核心靶点进行分子对接，最终得到60组受体-配体对接结果。在60组受体-配体结果中，其中Affinity < -6 kcal/mol的组合共有32组，超过50 %。其中对接得分最高的为：MMP9-芹菜素(apigenin)，对接得分最低的为CXCL8-棕榈酸(palmitic acid)和CXCL8-棕榈酸甲酯(methyl palmitate)，分值为-3.9 kcal/mol，这表明所筛选的潜在核心化合物与核心靶点之间可能具有较好的结合活性。对接结果可为今后进一步开展相关中药及成分的实验筛选提供数据支撑，分子对接结果见图 6。部分核心化合物对接结果示意图见图 7。
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| 图 6 分子对接结果 Fig. 6 Molecular docking results |
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| 注：A. MMP1-quercetin(槲皮素)；B. ALB-palmitic acid(棕榈酸)；C. TNF-kaempferol(山奈酚)；D. MMP9-apigenin(芹菜素)。 图 7 桑麻止咳汤部分核心化合物对接结果示意图 Fig. 7 Schematic diagram of the docking results of some core compounds in Sangma Zhike Decoction |
燥邪为西北燥证的主要致病因素为风、寒、热邪，饮食习惯与居住环境也属于其致病因素。燥邪从皮毛、口鼻而入，先伤气津，后伤阴血，传变至脏腑，于是形成由表及里、由气及血、由阳入阴的诸多脏腑交互影响的病证状态[6]。刘浩[7]研究表明，西北燥证与慢性支气管炎之间存在联系，西北燥证人群比非西北燥证人群患慢性支气管炎的几率高出5.523 8倍。西北燥证已经是导致慢性支气管炎发病的重要因素。
慢性支气管炎中医称为咳嗽，慢性咳嗽的发病率为3%~5%，老年人发病率为10%~15%[8]。慢性支气管炎多为虚实夹杂，病机与饮、痰、虚密切相关。对于慢性支气管炎急性发作期患者，多见于外邪犯肺，或痰湿郁肺，或痰热蕴肺，王成祥教授强调“急则治其标”，重在清肺化痰，祛邪利肺[9]。肺体，肺之形体，位于胸中隔上，覆盖心与心包者也。其病则司气失职，宣肃不利，邪客本体。于是呼吸有碍，气失宣肃，其以宣发不及为主者，见咳嗽、气急、气短等症；气郁痰结，则咳痰、胸闷、胁痛生焉。论其治也，当取清宣肺体之法，自拟桑麻止咳汤。桑麻止咳汤强于清化肺热、去除痰热，疏调全身气机。肺主一身之气，肺气清肃，才能使得全身气血运行顺畅。
该研究应用网络药理学对桑麻止咳汤进行分析，核心成分有槲皮素、棕榈酸、山奈酚和芹菜素等。其中槲皮素具有抗炎、抗病毒活性和调节免疫功能的作用[10]。槲皮素可以抑制鼻病毒在气道上皮细胞的复制，还可以降低促炎细胞因子的表达并改善鼻病毒感染小鼠的肺功能[11]。山奈酚在抑制炎症细胞功能以及抑制促炎细胞因子和趋化因子表达方面的有较好效果[12]。芹菜素具有多种生物学功能，如抗炎，抗氧化、抗菌、抗病毒等[13]。
桑麻止咳汤的作用核心靶点主要为TNF、MMP9和ALB等。TNF-α是一种促炎因子，在患有慢性阻塞性肺病的大鼠肺组织中表达上调，还可能使气道上皮结构失去完整性[14]。MMP9在慢性阻塞性肺病急性发作期水平明显升高，肺组织内的炎症细胞数增多，由此推断，MMP9水平失衡可能是COPD急性发作的重要原因[15]。ALB是一种有肝脏合成的中等大小的蛋白分子，也是人体血浆中重要的蛋白质，在炎症反应和氧化应激中起重要作用[16]。
桑麻止咳汤治疗西北燥证兼慢性支气管炎的作用通路可分为两类：1)炎症反应通路，如IL-17信号通路，IL-17可以通过刺激中性粒细胞，从而释放弹性蛋白酶，对肺组织产生损害，参与了慢性肺部疾病发病。同时IL-17可通过诱导炎症和趋化因子释放，加重气道和肺部炎症，还可通过影响黏液蛋白基因表达致使黏液分泌，从而加重气道炎症[17]。王燕等[18]发现，西北燥证患者存在免疫状态紊乱，其血清IL-17A水平明显升高，IL-17A募集炎症细胞，促进前炎症因子生成。2)免疫相关通路：如AGE-RAGE信号通路，抗RAGE抗体，RAGE的特异性抑制剂以及一些可以干扰或抑制RAGE表达和相关信号通路的化合物，可以用于治疗慢性支气管炎，防止迁延不愈，引发慢性阻塞性肺疾病[19]。
综上所述，该研究采用网络药理学对桑麻止咳汤治疗西北燥证兼CB的作用机制进行了初步分析，结果表明桑麻止咳汤是通过多成分-多靶点-多途径发挥治疗西北燥证兼CB的作用，为下一步研究提供了方向。
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