2023, Vol. 40文章信息
- 孟艳举, 王路, 王献清, 等.
- MENG Yanju, WANG Lu, WANG Xianqing, et al.
- 基于Raf-MEK-ERK信号通路探究梓醇对蛛网膜下腔出血大鼠脑组织损伤的影响
- Study on the impact of catalpol on brain tissue damage in rats with subarachnoid hemorrhage based on Raf-MEK-ERK signal pathway
- 天津中医药, 2023, 40(8): 1059-1064
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2023, 40(8): 1059-1064
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2023.08.19
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文章历史
- 收稿日期: 2023-04-17
2. 濮阳市人民医院麻醉科, 濮阳 457005
蛛网膜下腔出血（SAH）是一种破坏性的脑卒中，病死率和致残率较高，并伴有脑组织损伤和神经功能障碍，SAH后发生的早期脑损伤（EBI）被认为是导致SAH患者预后不良的关键因素[1]。在EBI的各种病理过程中，自噬、细胞凋亡、神经元直接死亡和坏死性凋亡是主要参与过程，其中自噬作为维持细胞和组织稳态的一个重要分解代谢过程，是缺血性细胞损伤中防止细胞凋亡的重要保护机制[2]。已有研究证明，SAH后激活自噬可抑制EBI中的神经元凋亡，具有神经保护作用[3]。梓醇具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化和抗细胞凋亡等多种药理作用，在神经系统疾病方面具有较好的治疗作用[4]。研究发现，梓醇对创伤性脑损伤后大鼠的氧化应激和神经炎症具有改善作用[5]，且梓醇可以改善炎症并促进自噬[6]，但梓醇对SAH脑组织损伤的改善作用与自噬是否有关尚不完全明确。丝裂原活化激酶（MAPK）通过调节丝/苏氨酸蛋白激酶（Raf）-丝裂原活化蛋白激酶（MEK）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）级联信号通路，激活ERK磷酸化，在细胞增殖、凋亡和自噬中起关键作用[7]。由于自噬受Ras/Raf/MEK/ERK信号通路调节，且Raf-MEK-ERK信号通路参与创伤性脑损伤后海马神经发生[8-9]，由此推测Ras/Raf/MEK/ERK信号通路可能通过调节自噬改善SAH后脑组织损伤。而梓醇对SAH大鼠脑组织损伤的影响与Raf-MEK-ERK信号通路是否有关尚未有相关报道，研究通过建立SAH大鼠模型，对其进行探讨。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠60只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，饲养环境温度22 ℃左右，湿度55 %，12 h光暗循环，不禁水食。
1.2 主要试剂与仪器梓醇（纯度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG、伊文思蓝（EB，北京索莱宝公司）；原位末端标（TUNEL）试剂盒、U0126（美国Sigma公司）；苏木素-伊红（HE）染色液、Triton X-100（上海源叶生物公司）；牛血清白蛋白（BSA）、DAPI（上海爱必信生物公司）；一抗Raf、MEK、磷酸化MEK（p-MEK）、ERK1/2、p-ERK1/2、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、自噬基因Beclin-1、微管连接蛋白轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和β-actin抗体（美国赛默飞公司）。光学显微镜，德国徕卡公司；分光光度计，奥地利TECAN公司。
1.3 模型分组、制备和给药将大鼠随机分为假手术组、SAH组、梓醇组、梓醇+U0126组（梓醇+Raf-MEK-ERK信号通路抑制剂U0126），每组15只。采用血管内穿孔法[10]构建大鼠SAH模型：麻醉大鼠，从颈外动脉残端将锋利的4-0单丝尼龙缝合线插入右内动脉，刺穿大脑前、中动脉分叉。造模大鼠出现呼吸急促、心率加快等症状，且剥离脑组织可见血性液体散在分布在脑底基底池部位，即为造模成功。假手术组与SAH大鼠接受相同的手术，但未对血管进行穿孔。造模术后1 h，对各组大鼠进行干预，梓醇组大鼠静脉注射10 mg/kg的梓醇[5]，梓醇+U0126组在梓醇组的基础上注射0.05 mg/kg U0126[11]，假手术组和SAH组注射相同剂量的生理盐水。每天1次，直至实验结束。
1.4 检测指标 1.4.1 神经功能评估造模后24 h采用改良Garcia法对大鼠进行神经学评分，评估自发活动、四肢运动的对称性、攀爬能力、触觉反应、前爪伸展和身体本体感觉，评分范围3~18分，评分越高神经功能越好。
1.4.2 SAH分级将大鼠脑基底池分为6部分，其中每部分分级标准如下：0级：无SAH；1级：少量SAH；2级：中度血凝，可见动脉；3级：血凝块阻塞节段内的所有动脉。等级范围从0~18。SAH分级评分小于7分的大鼠，没有明显的脑损伤。
1.4.3 脑组织含水量测定SAH后48 h麻醉处死大鼠，每组取5只大鼠采用标准干湿法测定脑含水量，取出造模侧大脑称质量以获得湿质量。然后将脑组织在100 ℃干燥24 h以获得干质量。脑水含量根据公式计算：（湿质量-干质量）/湿质量×100%。
1.4.4 血脑屏障通透性检测麻醉大鼠，处死前1 h每组取5只尾静脉注射2% EB溶液，体内循环1 h后开胸，心脏灌注生理盐水，分离取脑并称质量，脑组织以10 mL/kg的比例浸入甲酰胺溶液中后匀浆，60 ℃孵育24 h，用分光光度计在620 nm处测量渗出的EB染料。
1.4.5 HE染色观察脑组织病理变化取大鼠脑组织CA1区，每组5只，部分固定于4%多聚甲醛中（剩余冻存至-80 ℃），石蜡包埋，切片（5 μm）后用HE染色，在光学显微镜下观察。
1.4.6 免疫荧光染色取上述部分脑组织CA1区切片，用Triton X-100处理后BSA封闭，将样品与TUNEL试剂盒、一抗p-ERK1/2、LC3-Ⅱ（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜，洗涤后与荧光二抗在37 ℃下孵育1 h。并用DAPI进行核染，在显微镜下观察拍照，使用Imagepro Plus 6.0分析结果，并计算平均光密度（AOD）值。
1.4.7 蛋白免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达取上述冻存至-80 ℃的CA1区脑组织，裂解后提取总蛋白，定量后按步骤将蛋白SDS-PAGE电泳、转膜，5 %脱脂奶粉封闭2 h，在4 ℃下加入一抗Raf、MEK、p-MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ（1∶1 000）和内参β-actin过夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL发光显影，观察拍照，各条带灰度值用Image J软件处理分析。
1.5 统计学方法采用SPSS 26.0软件进行统计分析，数据采用均数±标准差（x±s），多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 大鼠神经功能评分和SAH分级比较与假手术组相比，SAH组大鼠神经功能评分减少，SAH分级显著增加（P＜0.05）；与SAH组相比，梓醇组大鼠神经功能评分增加，SAH分级显著减少（P＜0.05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126组大鼠神经功能评分减少，SAH分级显著下降增加（P＜0.05）。见表 1。
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与假手术组相比，SAH组大鼠脑组织含水量、EB渗出量显著增加（P＜0.05）；与SAH组相比，梓醇组大鼠脑组织含水量、EB渗出量显著减少（P＜0.05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126组大鼠脑组织含水量、EB渗出量显著增加（P＜0.05）。见表 2。
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假手术组海马CA1区神经元细胞形态正常，排列整齐，未观察到明显变性或坏死；SAH组神经元细胞排列相对松散，许多核固缩和核仁消失体积较小，染色较深，细胞数目减少；梓醇组神经元损伤明显减轻，结构相对整齐，细胞死亡较少；梓醇+U0126组相比于梓醇组神经元损伤加重。见图 1。
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| 注：A.假手术组；B.SAH组；C.梓醇组；D.梓醇+U0126组。 图 1 大鼠海马CA1区HE染色图（×400） Fig. 1 HE staining of rat hippocampal CA1 region (×400) |
与假手术组相比，SAH组TUNEL阳性细胞数目增加，凋亡率升高（P＜0.05）；与SAH组相比，梓醇组TUNEL阳性细胞数目减少，凋亡率降低（P＜0.05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126组TUNEL阳性细胞数目增加，凋亡率升高（P＜0.05）。见图 2和表 3。
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| 注：A.假手术组；B.SAH组；C.梓醇组；D.梓醇+U0126组 图 2 大鼠神经细胞凋亡情况（×400） Fig. 2 Neuronal apoptosis in rats (×400) |
与假手术组相比，SAH组的LC3-Ⅱ、p-ERK神经元阳性表达显著增强；与SAH组相比，梓醇组LC3-Ⅱ、p-ERK神经元阳性表达进一步增强；与梓醇组相比，梓醇+U0126组LC3-Ⅱ、p-ERK神经元阳性表达减弱（P < 0.05）。见图 3、图 4和表 4。
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| 注：A.假手术组；B.SAH组；C.梓醇组；D.梓醇+U0126组 图 3 大鼠脑组织CA1区LC3-Ⅱ表达（×400） Fig. 3 Expression of LC3-Ⅱ in CA1 region of rat brain tissue (×400) |
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| 注：A.假手术组；B.SAH组；C.梓醇组；D.梓醇+U0126组 图 4 大鼠脑组织CA1区p-ERK表达（×400） Fig. 4 Expression of p-ERK in CA1 region of rat brain (×400) |
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与假手术组相比，SAH组Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达升高，Bcl-2表达降低（P＜0.05）；与SAH组相比，梓醇组Bax蛋白表达降低，Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达升高（P＜0.05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126组Bax蛋白表达升高，Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达降低（P＜0.05）。见图 5和表 5。
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| 注：A.假手术组；B.SAH组；C.梓醇组；D.梓醇+U0126组。 图 5 大鼠自噬和凋亡蛋白表达变化 Fig. 5 Changes of autophagy and apoptosis protein expression in rats |
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与假手术组相比，SAH组Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达升高（P＜0.05）；与SAH组相比，梓醇组Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达进一步升高（P＜0.05）；与梓醇组相比，梓醇+U0126组Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低（P＜0.05）。见图 6和表 6。
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| 注：A.假手术组；B.SAH组；C.梓醇组；D.梓醇+U0126组 图 6 大鼠Raf-MEK-ERK通路蛋白表达变化 Fig. 6 Changes of Raf-MEK-ERK pathway protein expression in rats |
EBI是SAH患者急性脑损伤和神经功能障碍的最重要原因[12]。神经元死亡被认为是EBI的主要原因，可引发细胞毒性水肿和血脑屏障破坏。因此，减少神经元死亡的数量可改善SAH患者预后。研究发现，SAH大鼠神经元细胞数目减少，神经功能评分下降，SAH分级、脑组织含水量、血脑屏障通透性升高，表明SAH后发生脑水肿，出现神经功能障碍和脑损伤。梓醇具有神经保护作用，能有效改善急性脑缺血大鼠神经功能障碍和脑水肿，减少脑细胞凋亡[13]。研究SAH大鼠经梓醇干预后，神经元细胞数目增加，神经功能评分升高，SAH分级、脑组织含水量、血脑屏障通透性下降，表明梓醇能改善SAH后脑水肿，改善神经功能障碍和脑损伤。
神经元凋亡是SAH后血肿的机械压迫，血红蛋白的毒性损伤和氧化应激导致的，可引发EBI各种过程，是SAH患者预后不良的关键因素。研究表明，抑制细胞凋亡，可改善SAH后的EBI[14]。研究发现，SAH大鼠神经元细胞凋亡增加，促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，而梓醇干预后神经元细胞凋亡减少，表明梓醇能减少SAH大鼠神经元凋亡。自噬是一种高度调控的细胞内成分的降解方式，在多种中枢神经系统疾病中发挥重要作用，在SAH中发现自噬激活可以减少神经元凋亡，而抑制自噬会加重神经元凋亡[15]。研究发现，SAH大鼠自噬标志物Beclin-1、LC3-Ⅱ表达增加，而梓醇干预后Beclin-1、LC3-Ⅱ表达进一步增加。且有研究发现梓醇可通过增强自噬来改善糖尿病肾病足细胞损伤[16]，表明梓醇可能通过促进SAH大鼠自噬，减少神经元凋亡。
MAPK是一类广泛存在于哺乳动物细胞中的激酶参与细胞生长、发育、分化、凋亡和细胞间功能同步等多种过程[17]。Raf/MEK/ERK信号通路通过磷酸化上游Raf分子激活下游分子ERK，将信号从膜传递到细胞内参与调节生理和病理过程中的细胞分裂、增殖、自噬和凋亡等[7]。ERK在SAH引发的脑损伤中发挥重要作用，通过激活MEK/ERK通路并上调其蛋白表达增强突触可塑性，改善SAH后脑损伤[18]。Raf/MEK/ERK通路在细胞凋亡和自噬中都起关键作用，Li等[19]发现通过激活Raf/MEK/ERK介导的细胞自噬可减轻脂多糖引起的鼠肾足细胞凋亡。此外，Sun等[20]发现骨桥蛋白通过黏着斑激酶（FAK）-ERK途径增强自噬改善大鼠SAH后的EBI。研究中SAH组Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2表达升高，Raf/MEK/ERK通路激活，梓醇进一步促进Raf/MEK/ERK通路的激活，与自噬蛋白表达趋势一致。且ERK抑制剂U0126逆转了梓醇对SAH大鼠脑损伤的改善作用，表明梓醇可能是通过激活Raf/MEK/ERK信号通路发挥对SAH后脑损伤的改善作用。
综上所述，梓醇能改善大鼠SAH后脑损伤，减少细胞凋亡和神经功能障碍，其作用机制可能与激活Raf/MEK/ERK信号通路而增强自噬有关。该研究为改善SAH后脑损伤提供了新思路，但梓醇对大鼠SAH后脑损伤的其他分子机制仍有待阐明。
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2. Department of Anesthesiology, Puyang People's Hospital, Puyang 457005, China