2023, Vol. 40文章信息
- 张博纶, 鞠宝兆, 张咪, 等.
- ZHANG Bolun, JU Baozhao, ZHANG Mi, et al.
- 基于网络药理学-分子对接探讨益气养阴通络方抗类风湿关节炎的作用机制
- Discussion on the mechanism of Yiqi Yangyin Tongluo Recipe in anti-rheumatoid arthritis based on network pharmacology-molecular docking
- 天津中医药, 2023, 40(8): 1065-1074
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2023, 40(8): 1065-1074
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2023.08.20
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文章历史
- 收稿日期: 2023-05-23
2. 青岛市第六人民医院, 青岛 266000;
3. 辽宁中医药大学附属医院, 沈阳 110032;
4. 中国中医科学院广安门医院, 北京 100000;
5. 北部战区总医院第二派驻门诊, 沈阳 110015
类风湿关节炎（RA）是一种以全身对称表现侵蚀特征的严重自身免疫性疾病，是破坏关节的系统性关节炎中最普遍的原因，被称为“不死的癌症”[1]。治疗上目前无根治方法，以改善、减缓为主。中医根据症状相关，认为RA症状体征属“痹证”“尪痹”范畴，虚则肝肾、气阴、气血虚损，实则风湿、寒湿、湿热作祟，痰瘀阻滞，传统医学经辨证论治、四诊合参，治疗上虚予益气、滋阴、养肝、补肾，实予寒者热之、热者寒之、湿者燥之、滞者通之[2]。而痹证日久，必然出现以关节虚痛、肿大为主，伴肌肉酸痛，乏力气短，口眼干涩为主要表现的气阴两虚证。气阴两虚，则脏腑肢节均未得濡润滋养而发为虚痛。故治疗上以益气滋阴，荣络止痹为主，方随法立，提出益气养阴通络方以荣血脉肢络之损，止脏腑肢节之痛。益气养阴通络方源于古方“四神煎”，四神煎用治于RA为笔者所在课题组于2017年《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》中首次明确，该方由生黄芪、石斛、远志、牛膝、金银花协成，具体组方配伍意义在讨论中详述，总而言之，该方发挥益气滋阴，荣络止痹之功，用于治疗关节肿大为主证的痹证，同时伴随肌肉酸痛、气短乏力、口干眼涩、自汗、盗汗等气阴两虚证。
益气养阴通络方治疗RA的临床疗效与安全性在课题组的前期临床试验中已经明确，试验表明该方在改善关节炎症状体征、降低炎性因子滴度、降低中医证候评分及安全性方面有显著优势[3]，但是由于四神煎治疗RA的明确提出距今仅6年，且复方药物组成复杂，因此该方干预RA疗效产生机制的详细研究明显不足，支撑其治疗功效的生物活性化合物仍不清楚，限制了该方的深入挖掘与发展。而通过网络药理学与分子对接，能够初步明确复方干预RA的主要成分、可能作用靶点及信号通路，至此，笔者所在课题组将进一步对预测通路进行体内外实验验证，以实现复方干预RA机制的清晰化，为临床研究与应用提供指导意义。
1 材料与方法 1.1 益气养阴通络方成分筛选及靶点预测在中医药系统药理学平台（TCMSP，http://tcmsp-e.com/），以益气养阴通络方组方中“黄芪”“牛膝”“金银花”为关键词，筛选出口服生物利用度（OB）≥30、类药性（DL）≥0.18的有效成分。益气养阴通络方组方中“石斛”“远志”无法在TCMSP中检索，因此在本草组鉴（HERB，https://herb.co）中以中药名称为关键词检索，获得“related ingredients”后，通过Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索获得药物成分化学式（Canonical SMILES ID）。此外，查阅近5年相关中药文献补充各中药化学成分信息。将TCMSP、HERB-Pubchem及文献补充获取的成分信息通过Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行潜在作用靶点的预测，靶点筛选结束后，借助UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）实现蛋白靶点名称的格式一致性处理。
1.2 类风湿关节炎相关靶点筛选选取关键词“rheumatoid arthritis”“rheumatoid”在Genecards数据库（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https://omim.org/）和DRUGBANK（https://go.drugbank.com）中筛选疾病关键靶点，其中DRUGBANK主要用于RA临床一线西药的靶点挖掘，如甲氨蝶呤，反向补充RA疾病靶点数据库。经过反向补充后，进行合并后去重，获得最终的RA靶点。
1.3 构建“益气养阴通络方-成分-靶点”网络和蛋白相互作用（PPI）网络将益气养阴通络方组方单味药名称“黄芪”“石斛”“远志”“牛膝”“金银花”及各单味药潜在靶点-活性成分输入Cytoscape 3.8.0软件，通过计算对益气养阴通络方进行拆解，构建“药物-成分-靶点”网络图以实现益气养阴通络方成分靶点的可视化。将益气养阴通络方成分和RA靶点上传到韦恩图绘制平台[Venny 2.1.0（csic.es）]，绘制出体现益气养阴通络方与RA可能靶点交集的VENN图，预测出复方干预RA的治疗靶点情况。将靶点蛋白交集数据上传String 11.0数据库（https://string-db.org/），经过计算获得益气养阴通络方抗RA在蛋白质层面的可视化蛋白相互作用图，随后通过Cytoscape 3.8.0数据库的Bisogenet插件计算度值，通过调节交集靶点的度值（Degree值），使Degree大于60，得出交集蛋白的核心基因。
1.4 复方成分-RA靶点-通路的富集分析整理交集靶点数据，按照要求录入Metascape平台（https://metascape.org），设置P＜0.01为选择意义，进行经典的基因本体（GO）功能获得重要交集靶点的细胞组分（CC）、生物过程（BP）及分子功能（MF），进行KEGG通路富集分析（https://www.kegg.jp/）获得益气养阴通络方干预RA可能的关键作用通路。对GO和KEGG结果分别选取前10个和25个条目，通过Bioinformatics（https://www.bioinformatics.org）将数据转化为可视化图片。
1.5 构建复方成分-RA靶点-通路网络图将复方活性成分、潜在治疗靶点及KEGG富集前25条通路导入Cytoscape 3.8.0软件构建“药物-成分-靶点-通路-疾病”网络，利用CytoNCA插件计算网络中度值、中心介度、紧密度等拓扑学参数，根据度值设置图形大小，度值越高，图形越大，地位越重要。将益气养阴通络方成分、靶点与疾病靶点之间，以信号通路相连接，获得益气养阴通络方作用于RA后，发挥治疗作用的靶点蛋白与通路。
1.6 分子对接验证该研究拟验证4个核心靶点，首先是SRC和STAT3，两者在核心靶点中度值最高，可能最关键，所以选择两者进行分子对接验证。另外，PIK3R1、AKT1的选择是考虑到研究后续拟开展PI3K/AKT信号通路介导细胞自噬的验证，PI3K作为PI3K/AKT信号通路的上游，是该通路的始动点，PIK3R1是PI3K的P85亚基，对PI3K功能有重要作用，故选其进行对接验证，AKT是PI3K/AKT信号通路的关键蛋白，自噬主要由AKT家族中的AKT1介导，同时网络药理学结果预测的靶点为AKT1，故选择AKT1与关键成分进行对接。综上，该研究选取这4个关键靶点与关键成分进行分子对接验证。
首先从RSCB蛋白质结构数据库（PDB，https://www.rcsb.org/）中下载SRC（PDB ID：1a07）、STAT3（PDB ID：6njs）、PIK3R1（PDB ID：1pbw）、AKT1（PDB ID：6hhj）的晶体复合物用于分子对接研究，获得3D结构后，以PDB格式导出。然后进行蛋白受体选择，首先根据小分子的结构特点，首选结构类似的小分子与蛋白的晶体复合物结构进行对接，再进一步根据分辨率选择结构更加准确的蛋白晶体作为受体，筛选分辨率时，根据?魡值，?魡值越小，分辨率越高，结构越准确。经PyMOL 2.4.1软件，Auto Dock 4.2.6软件完成蛋白靶点去水和去配体、靶蛋白加氢和计算电荷，最终获得活性成分和靶点的结合分数，以结合能大小初步评价对接效果。然后通过Auto Dock Vina 1.1.2软件进行对接[4]，将对接结果录入PyMOL 2.4.1进行数据可视化，获得分子对接作用模式图。
2 结果 2.1 益气养阴通络方活性成分及有效作用靶点通过TCMSP（OB≥30%，DL≥0.18）、HERB并结合文献，筛选后共收集到益气养阴通络方组方中5味中药（黄芪、石斛、远志、牛膝、金银花）的83种活性成分，大于10类化学成分者取前10类，不足者全部列出，黄芪、牛膝、金银花、石斛、远志的活性成分数分别为20、20、23、13、7种，其中山奈酚和槲皮素为黄芪、牛膝和金银花共有，豆甾醇和β-谷甾醇为牛膝和金银花共有（表 1）。通过Swiss Target数据库预测有效成分靶点，共预测出779个潜在靶点。
RA相关靶点在Genecards、OMIM数据库中分别获得5 017、525个，剔除重复值后，实际获得5 393个靶点，与益气养阴通络方的779个潜在靶点取交集，获得465个交集靶点，提示益气养阴通络方可能通过这些靶点改善RA，绘制VENN图，见图 1。利用Cytoscape 3.8.0软件绘制益气养阴通络方治疗RA的“药物-成分-靶点”网络图（图 2），图中绿色圆形代表药物成分，V形代表药物成分，其中下方独立的4个成分为多味中药共有，中间浅蓝色椭圆形代表潜在靶点，从图中可以看出益气养阴通络方、成分、靶点之间彼此连接又相互作用，体现了益气养阴通络方多成分、多靶点协同作用的特征。
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| 图 1 益气养阴通络方靶点与RA互作靶点VENN图 Fig. 1 VENN diagram of crossing target of Yiqi Yangyin Tongluo Recipe and rheumatoid arthritis |
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| 注：HQ.黄芪；SH.石斛；YZ.远志；NX.牛膝；JYH.金银花 图 2 “益气养阴通络方药物-成分-靶点”调控网络图 Fig. 2 "Yiqi Yangyin Tongluo Recipe drugs-ingredient-targets" network |
益气养阴通络方与RA交集后所得465个靶点信息上传至String 11.0数据库，获得相关网络信息并利用Cytoscape 3.8.0重新构建靶蛋白PPI网络（图 3）。得到PPI网络后，运用Cytoscape 3.8.0中的Bisogenet插件计算度值，筛选出度值大于60的核心靶点基因，分别为SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、HSP90AA1、PIK3R1、GRB2、AKT1、PIK3CA（图 4），通过Cytoscape 3.8.0插件Cyto NCA计算9个核心基因相关信息（表 2），其中SRC度值83，是益气养阴通络方治疗RA最可能的作用靶点，此外，STAT3、MAPK3、MAPK1、PIK3R1、AKT1、PIK3CA等度值也较高，提示相关靶点可能是益气养阴通络方治疗RA发挥作用。
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| 图 3 PPI蛋白互作网络图 Fig. 3 Protein-protein interaction network |
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| 图 4 核心靶点PPI图 Fig. 4 Protein-protein interaction network of core targets |
GO功能分析结果显示，BP有明显的关键富集进程，即肽基酪氨酸自体磷酸化，CC关键富集于质膜细胞质侧的外部成分，MF关键富集于非膜跨蛋白酪氨酸激酶活性和细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶活性（图 5A）。图 5B为KEGG富集分析结果，图中气泡越大，关联基因数越多，颜色越红，P值越小。图 5B中展示了益气养阴通络方干预RA排名前25的信号通路（P＜0.05），主要生物学过程包括癌症相关、PI3K-AKT、癌症相关蛋白聚糖、神经活性配体-受体相互作用、HF-1、ErbB及VEGF信号通路等，提示益气养阴通络方可能通过这些信号途径改善RA。根据KEGG和GO富集结果，在P＜0.05范围内，参考count值，并结合PPI结果，推测PI3K-AKT信号通路可能是益气养阴通络方治疗RA的重要通路之一。同时，结合查阅文献，发现其在胶原诱导性关节炎大鼠中存在表达异常，因此选其进行后续分子对接与验证[3]。
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| 注：A.GO富集分析结果；B.KEGG通路富集分析结果。 图 5 益气养阴通络方成分-RA靶点-通路富集分析 Fig. 5 Yiqi Yangyin Tongluo Recipe components-RA target-pathway enrichment analysis |
Cytoscape 3.8.0构建益气养阴通络方“药物-成分-靶点-通路-疾病”网络图（图 6），网络图中，共有856个节点，5 116条边，包括1种疾病，前25条信号通路，5味药物及其73个活性成分和752个靶点。图中度值越高，节点形状越大，说明该节点越关键，在活性成分中，槲皮素、山奈酚、川芎哚度值较高；在潜在治疗靶点中，CYP19A1、ESR1、ESR2等度值较高；在信号通路中，度值排名前3为癌症通路、PI3K-AKT信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路，以上结果提示上述成分、靶点及通路可能是复方改善RA的关键组分。
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| 图 6 益气养阴通络方成分-RA靶点-通路网络图 Fig. 6 Yiqi Yangyin Tongluo Recipe composition-RA target-pathway network diagram |
根据PPI及KEGG分析结果，研究选定益气养阴通络方的11种主要活性成分与关键靶点SRC、STAT3、PIK3R1、AKT1进行对接，结果见图 7，图中数值代表Affinity的绝对值，Affinity的绝对值越大，颜色越深，说明蛋白与活性成分的结合越牢固，越有可能相互作用，图中Affinity≤-5.0 kJ/mol者占总数93.18%，其中Affinity≤-7.0 kJ/mol者占总数47.72%，结果表明益气养阴通络方大部分成分与关键靶点的结合活性较佳，其中与AKT的结合可能最大，提示益气养阴通络方药物可能通过作用于这些关键靶点而发挥作用。
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| 图 7 分子对接结果热图 Fig. 7 Heat map of molecular docking results |
挑选结合能最低的靶蛋白-化合物的最优构象进行可视化，通过对接构象展现两者之间的相互作用（图 8）。图 8中，SRC与shihunin对接可视化中，shihunin可能借助氢键与SRC的THR-182[5]和THR-183[6]氨基酸残基相互作用；STAT3与Inophyllum-E对接可视化中，Inophyllum-E可能借助氢键与STAT3的ASP-369和LEU-438[7]氨基酸残基相互作用；PIK3R1与Inophyllum-E对接可视化中，Inophyllum-E可能借助氢键与PIK3R1的HIS-234[8]、ARG-228[9]和TRP-237[10]氨基酸残基相互作用；AKT1与Chryseriol的对接可视化中，Chryseriol可能借助氢键与AKT1的ASN-199、ASN-53[11]和SER-216[12]氨基酸残基相互作用。
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| 图 8 分子对接可视化结果 Fig. 8 Visualization results of molecular docking |
RA病变表现为常累及滑膜、腕和足等多关节炎症，同时伴结节的形成[13-14]，同时又与许多炎症性疾病相似，具有静止（缓解期）和加重发作（活动期）的特征[15]。RA是由患者自身遗传因素和环境因素间相互交织，引致自身免疫功能失调的疾病[16]。目前，西医学较认可的治疗方案较经典，包括传统抗风湿药、小剂量糖皮质激素、生物制剂等，然而，这些常规治疗的效果不尽如人意，甚至只产生部分有效反应，关节症状持续缓解实现不良，需要持续的药物治疗[17]。但是药物的长期干预，必然会出现相应的毒副作用，不仅侵害患者的身体、心理，甚至会加重患者的经济负担、降低生活质量。中药制剂的干预在医学界受到普遍的认同，具有增强疗效、减弱不良反应及改善血清学指标的作用，因此，中西医联合疗法的预期前景非常好。课题组前期研究已明确该方干预RA的临床疗效与安全性，但是目前缺少关于干预机制的研究，干预机制的明确将会为该方的临床应用提供实验基础。
益气养阴通络方基于古方“四神煎”而立[18]。四神煎为2017年《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》中首次明确，其用治于RA的相关基础研究尚且不足，研究通过网络药理学的方法对其干预RA的作用靶点和信号通路进行挖掘和预测，便于之后开展相关基础研究。方中生黄芪重用，不仅专补气，“善达皮腠，专通肌表”，又“逐五脏间恶血”（《本草经集注》），现代研究证实本品确有活血之效[19]，故作“疗皮水风湿之疾，历节肿痛最效”。石斛，强阴益精，生津养胃，补内绝不足。远志，益精补阴气，“长肌肉，助筋骨”，又散郁豁痰，使湿毒孤立，络通痛止。川牛膝，善活血止痹，益肝肾，强筋骨，又可引药达所，锚定而效，通络除下肢痹痛。与生黄芪同用，走而能补，引而通痹。金银花，清补兼顾，常以清解络毒，然银花“补之性实多于攻”“少用则补多于攻”“且能补气，更善补阴”（《本草新编》），因此方中银花以15 g入方，以补虚为主，尤补阴虚，又可入络清解虚实之毒。痹为久疾、顽疾，不能遽通，当培本行滞，荣络止痹为主，辅以活血通络，因此方中以益气养阴为主，寓通于补、荣脉通痹，阳生阴长。诸药相伍，本虚得资，标实得清，补而不滞，通而不遽，正邪兼顾，共奏益气滋阴，荣络止痹之功。现代研究表明，调控炎症反应是防止RA关节病理进展的重要干预手段[20-21]。研究表明，黄芪核心成分黄芪多糖、黄芪甲苷均能够减轻炎症反应，黄芪总皂苷促进滑膜成纤维细胞凋亡，抑制炎症反应[22]；霍山石斛茎的重要成分多糖参与免疫调节，且可以通过干预炎性进展，缓解关节滑膜炎性病变[23]；远志皂苷能够减轻细胞氧化损伤，降低细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平[24]；川牛膝中所含有的甾体具有体外抗炎作用[25]；金银花醇提物的抗炎作用非常明确，研究表明抗炎机制与减少MDA、NO含量及SOD活性有关[26-27]。益气养阴通络方不仅组方配伍上定而施效，现代药理学亦能有效支持各单味药的有效性。
研究通过网络药理学与分子对接技术对益气养阴通络方干预RA的可能作用靶点和信号通路进行预测与验证，从分子层面为益气养阴通络方发挥疗效进行基础的完善与延伸。通过网络药理学共筛选出益气养阴通络方的83种活性成分和779个潜在靶点，RA相关靶点5 393个，益气养阴通络方成分与RA疾病交集靶点465个，其中交集核心靶点9个，分别为SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、HSP90AA1、PIK3R1、GRB2、AKT1、PIK3CA。SRC家族激酶影响多种细胞信号通路，这些通路调节细胞的运动、生存、增殖、黏附和侵袭。研究证明，在实验性关节炎模型中，SRC激酶敲除小鼠由于炎性细胞产生细胞因子和趋化因子功能存在缺陷，因此可免受炎症细胞浸润炎症关节。在RA患者中，滑膜细胞和滑膜巨噬细胞存在过表达的SRC。SRC激酶在体内和体外均具有抗关节炎的潜力[28]。研究表明，B细胞中STAT3去甲基化修饰参与调控类风湿关节炎[29]。另一项研究证实STAT3是RA滑膜细胞存活所必需的调节因子并且STAT3抑制剂已被提议作为RA治疗的候选药物[30]。MAPK1、MAPK3是MAP激酶家族的成员，均参与级联反应，并发挥重要作用，该级联通过响应各种细胞外信号来调节多种细胞过程，如增殖、分化和细胞周期[31]。MAPK信号转导通路调控炎性细胞因子和细胞转导通路，从而影响关节炎症和破坏[32]。研究表明，MAPK1调节Bcl-2表达并激活caspase级联反应[33]。MAPK3促进RUNX2的表达和定位MAPK3影响成骨细胞分化[34]。HSP90AA1在改善软骨代谢[32]，参与DNA损伤调节、细胞周期调节、基因表达和致癌作用中发挥重要作用[35]。另一项研表明，HSP90AA1作为分子伴侣，辅助细胞内分子组装和蛋白质折叠，参与成纤维细胞活化的多个过程[36]。GRB2是一种支架蛋白，GRB2与FAK的结合，并导致细胞外信号调节激酶1/2（ERK）的激活[37]。GRB2通过GRB1-PI3K-AKT通路促进心脏肥大[38]，对心脏纤维化调节至关重要。PI3K是一种异质二聚体，由PIK3R1和PIK3CA基因构成，两者分别编码PI3K催化亚基p110α和调节亚基p85α，此外还由其他编码PI3K相关调节因子的基因组成。PI3K通路活性，受到多因素的调控，其中PIK3CA和PIK3R1功能性突变产生的互斥关系是调控通路激活或抑制的重要环节[39]。综上所述，益气养阴通络方与RA的9个核心交集靶点均从不同角度、不同途径影响炎性进程或RA。
GO功能分析与KEGG富集分析表明，益气养阴通络方干预RA的可能作用通路包括PI3K-AKT、癌症相关及神经活性配体-受体相互作用等多条通路，其中PI3K-AKT信号通路是益气养阴通络方干预RA可能性最大的通路之一。分子对接中，益气养阴通络方的11种主要活性成分与关键靶点SRC、STAT3、PIK3R1、AKT1均有较稳定的结合，其中与AKT的结合可能最大。AKT是PI3K-AKT信号通路的重要下游蛋白，因此初步验证了PI3K-AKT信号通路可能是益气养阴通络方干预RA的关键通路之一。PI3K-AKT信号通路是一种细胞内信号通路，参与细胞凋亡、血管生成、自噬等进程[40]。蛋白激酶B（AKT）在I3K/AKT信号通路中扮演信号转导枢纽的角色，AKT的活化靶向调控下游因子，如mTOR蛋白复合体、Bcl-2家族蛋白Bax、Bcl-2凋亡相关的启动子等多种蛋白，引起连锁反应发挥细胞稳态调节功能[41]。
综上所述，基于网络药理学与分子对接，以益气养阴通络方为研究对象，以RA为干预目标，通过网络药理学与分子对接初步预测并验证了益气养阴通络方干预RA的作用靶点与信号通路。笔者通过网络药理学预测所得药物干预疾病的可能作用通路，为益气养阴通络方的临床有效使用提供一定的证据支持。
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3. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110000, China;
4. Guang'anmen Hospital, Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100000, China;
5. The Second Outpatient Department of the General Hospital of the Northern Theater Command, Shenyang 110015