2023, Vol. 40文章信息
- 冯燕枝, 牛冰, 叶贝贝.
- FENG Yanzhi, NIU Bing, YE Beibei.
- 雪松醇调节miR-503-5p/TCF3轴对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响
- Effect of cedarol on proliferation, migration and invasion of breast cancer cells by regulating miR-503-5p/TCF3 axis
- 天津中医药, 2023, 40(9): 1183-1189
- Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine, 2023, 40(9): 1183-1189
- http://dx.doi.org/10.11656/j.issn.1672-1519.2023.09.16
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文章历史
- 收稿日期: 2023-04-18
乳腺癌（BC）是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球女性癌症死亡的主要原因[1]。尽管通过手术、化疗和放疗、内分泌治疗等对BC进行系统治疗有一定的效果，但因存在着不良反应、高成本和耐药性等局限性，因此仍需要开发更有效、毒性更低的新型药物，优化现有的治疗方法，以改善BC的预后，提高BC患者的生活质量[2-4]。雪松醇是一种天然倍半萜烯醇，已被证明具有广泛的生物活性，如抗菌、抗炎、镇痛、抗焦虑和抗癌作用[5]。研究发现，雪松醇可抑制胶质母细胞瘤[6]、肺癌[7]、结直肠癌[8]的发生发展。微小RNA（miRNA）表达失调与BC增殖、迁移和侵袭密切相关，多项报道显示，多种miRNA已成为BC药物干预的新靶点[9-10]。miR-503-5p作为重要的miRNA之一，在胃癌、结肠癌中下调表达，促进其表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化[11-12]。miR-503-5p在BC中的作用尚不清楚。T细胞因子3（TCF3/TCF7L1）在BC中高表达，并能促进三阴性BC细胞的增殖、迁移和侵袭[13]。经生物信息学分析显示，miR-503-5p与TCF3之间存在结合位点，推测miR-503-5p可能通过调节TCF3影响BC的增殖、迁移和侵袭。但雪松醇通过调节miR-503-5p/TCF3轴对BC细胞增殖、迁移和侵袭的影响还不甚清楚，因此本实验旨在探讨雪松醇对BC细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制，以期为临床治疗BC提供一定的参考价值。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本收集、细胞来源和实验动物2021年3月—2022年12月期间收集在本院首次确诊为BC患者的癌组织以及距离癌组织3 cm处的癌旁组织，共36对。所有患者均未接受化疗或放疗等形式的治疗，且签署了知情同意书，本研究获得本院伦理委员会的批准（批件号20210018）。人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A及人BC细胞MCF7、MDA-MB-231、SKBR3购于美国ATCC。4周龄SPF级BALB/c裸鼠购自郑州大学（河南省实验动物中心），许可证号：SCXK（豫）2022-0001，体质量15~20 g。
1.1.2 主要试剂与仪器雪松醇（货号J14535），上海金穗生物科技有限公司；噻唑蓝比色法（MTT）试剂盒（货号：MH1001），江苏麦格生物科技有限公司；细胞转染试剂盒（货号：SY0944），北京伊塔生物科技有限公司；DMEM培养基（货号：M0108B），上海盈湾生物科技有限公司；细胞蛋白提取试剂盒（货号：SH-2473），北京凯诗源生物科技有限公司；RNA提取试剂盒（货号：R1200-100）、反转录试剂盒（货号：RP1105）、胸腺嘧啶核苷类似物（Edu）apollo 488 in vitro试剂盒（货号：CA1172），北京索莱宝科技有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒（货号：IBIO-C583），江西艾博因生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：RG029S），上海碧云天生物技术有限公司；兔源一抗增殖细胞核抗原（PCNA，货号：ab15498-PCNA）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2，货号：ab37150）、TCF3（货号：ab229605）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，货号：ab9485）一抗抗体，美国Abcam公司；辣根酶标记羊抗兔二抗（货号：XY0650），上海信裕生物科技有限公司；miR-503-5p引物购自广州RiboBio；miR-503-5p抑制剂（miR-503-5p inhibitor）及对照（inhibitor-NC）、miR-503-5p模拟物（miR-503-5p mimic）及其对照（mimic-NC）购自上海吉玛生物公司；多功能酶标仪（型号：LD-96A），山东莱恩德智能科技有限公司；离心机（型号：5424），艾本德中国有限公司；实时荧光定量PCR仪（型号：CFX96 Touch），上海艾研生物科技有限公司；光学显微镜（型号：CX31），日本奥林巴斯公司。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养将人正常乳腺上皮细胞MCF-10A及人BC细胞MCF7、MDA-MB-231、SKBR3置入DMEM的培养基中，在恒温培养箱中常规培养。定期观察，及时更换新的培养基。用0.25 %胰蛋白酶消化传代，收集对数生长期的细胞进行实验。
1.2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）法检测miR-503-5p表达组织和细胞的总RNA用TRIzol试剂提取。以RNA为模板合成cDNA后，再以cDNA为模板配置qRT-PCR反应体系。miR-503-5p上游引物：5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTC ATA-3′和下游引物：5′-GTAATACGGTTATCCACGC G-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；以2-ΔΔCT法计算组织和细胞中miR-503-5p的相对表达量。
1.2.3 MTT实验检测细胞增殖将对数生长期细胞以1×104/孔，接种到96孔板中常规培养，设6个复孔，培养24 h后吸去原培养液，加入含0、14、28、56、112、225 μmol/L雪松醇[5]的培养液48 h后加入MTT溶液20 μL/孔，再培养4 h后，加入二甲基亚砜150 μL/孔，充分震荡后，在酶标仪上于490 nm波长处检测各孔的吸光度（A490）值，细胞增殖抑制率（%）=[（A对照-A实验）/（A对照-A空白）]×100%。
1.2.4 细胞转染及干预将细胞分为control组（正常培养）、雪松醇组（112 μmol/L干预）、inhibitor-NC（转染inhibitor-NC）、miR-503-5p inhibitor组（转染miR-503-5p inhibitor），对各组转染组细胞进行转染24 h，除control组外，再用雪松醇进行干预48 h，随后按照1.2.2中qRT-PCR法方法检测各组miR-503-5p的表达。
1.2.5 细胞增殖实验各组MCF7细胞在96孔板上接种，浓度为1×104/孔，设6个复孔。随后进行常规培养24、48、72 h后每孔加入20 μL MTT溶液。继续培养4 h每孔再加入150 μL的二甲基亚砜，在酶标仪上于490 nm波长处检测各孔的OD值。另取MCF7细胞接种至96孔板中，培养24 h后，每孔加入50 μM Edu孵育2 h，弃去培养液，加入50 μL的4 %多聚甲醛固定30 min，洗去固定液，每个孔加入100 μL的1×Apollo染色反应液，避光孵育30 min后，细胞核用DAPI溶液复染，荧光显微镜下观察，计算Edu阳性细胞比例。
1.2.6 Transwell小室检测细胞迁移与侵袭将各组MCF7细胞使用无血清培养基稀释，接种至不含有Matrigel基质胶（迁移实验）或含有Matrigel基质胶（侵袭实验）的Transwell上室，下室加入完全培养基，24 h后，用4 %多聚甲醛固定30 min，并用0.5 %结晶紫染色20 min，显微镜下随机选择6个视野细胞计算迁移与侵袭细胞数。
1.2.7 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测PCNA、MMP-2、TCF3蛋白表达采用试剂盒提取组织和细胞总蛋白，对蛋白进行定量、电泳分离。转PVDF膜后室温封闭2 h，最后再分别加入PCNA（1∶1 000）、MMP-2（1∶2 000）、TCF3（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗在4℃条件下孵育过夜，加入二抗（1∶2 000）在37 ℃条件下孵育90 min。Image J软件分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白的相对表达水平。
1.2.8 双荧光素酶报告基因实验构建TCF3野生型质粒和突变型质粒（TCF3-WT，TCF3-MUT），将TCF3-WT和TCF3-MUT分别与mimic-NC或miR-503-5p mimic共转染于MCF7细胞，48 h后用荧光酶标仪检测荧光素酶活性，并计算萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性比值。
1.2.9 体内肿瘤形成实验4周龄BALB/c裸鼠适应性饲养1周后，皮下注射200 μL（5×106）MCF7细胞悬液，每天观察肿瘤生长情况，待肿瘤体积达到50 mm3后，将裸鼠分成两组（10只/组）：对照组、雪松醇组，雪松醇组皮下注射150 mg/kg雪松醇，2 d/1次，共给药10次。给药结束后测量小鼠质量，颈椎脱臼处死小鼠并分离肿瘤，测量肿瘤质量与体积，qRT-PCR检测移植瘤组织中miR-503-5p表达，免疫组化法检测TCF3、MMP-2蛋白表达。
1.3 统计学方法Graphpad Prism 7.0软件用于分析数据。数据采用均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-503-5p与TCF3在组织和细胞中的表达与癌旁组织比较，BC组织中miR-503-5p表达水平降低（1.00±0.02 vs. 0.25±0.02），TCF3蛋白表达水平（0.31±0.04 vs. 1.57±0.11）升高（P<0.05），见图 1。与MCF-10A细胞比较，MCF7、MDA-MB-231、SKBR3细胞中miR-503-5p表达水平降低，TCF3蛋白表达水平升高，且MCF7细胞中miR-503-5p表达水平最低，TCF3蛋白表达水平最高，因此，选择MCF7细胞进行转染实验，见图 2和表 1。
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| 图 1 Western blot检测组织中TCF3蛋白表达 Fig. 1 Western blot detection of TCF3 protein expression in tissues |
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| 图 2 Western blot检测细胞中TCF3蛋白表达 Fig. 2 Western blot analysis of TCF3 protein expression in cells |
与0 μmol/L比较，MCF7细胞增殖抑制率在14、28、56、112、225 μmol/L雪松醇处理下以剂量依赖性的方式（6.14±1.15）%、（12.78±2.10）%、（25.58±2.47）%、（43.64±3.12）%、（56.84±3.28）%显著增加（P＜0.05），本研究选取112 μmol/L雪松醇进行后续实验。
2.3 雪松醇对MCF7细胞中miR-503-5p表达的影响与control组（1.00±0.01）比较，雪松醇组MCF7细胞中miR-503-5p表达水平（1.87±0.15）显著升高（P＜0.05）；与雪松醇组、inhibitor-NC（1.85±0.12）比较，miR-503-5p inhibitor组MCF7细胞中miR-503-5p表达水平（0.15±0.01）显著降低（n=6，P＜0.05）。
2.4 雪松醇对各组MCF7细胞增殖的影响与control组比较，雪松醇组MCF7细胞在24、48、72 h的OD490值和Edu阳性细胞率显著降低（P＜0.05）；与雪松醇组、inhibitor-NC比较，miR-503-5p inhibitor组MCF7细胞在24、48、72 h的OD490值和Edu阳性细胞率显著升高（P＜0.05），见图 3和表 2。
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| 图 3 Edu染色观察各组细胞增殖（比例尺=50 μm） Fig. 3 Observation of cell proliferation by Edu staining in each group(bar=50 μm) |
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与control组比较，雪松醇组MCF7细胞迁移与侵袭数显著降低（P＜0.05）；与雪松醇组、inhibitor-NC比较，miR-503-5p inhibitor组MCF7细胞迁移与侵袭数显著升高（P＜0.05），见图 4和表 3。
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| 图 4 Transwell检测各组MCF7细胞迁移与侵袭（比例尺=100 μm） Fig. 4 Migration and invasion of MCF7 cells detected by Transwell in each group(bar=100 μm) |
| 个 | |||||||||||||||||||||||||||||
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与control组比较，雪松醇组MCF7细胞中PCNA、MMP-2、TCF3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与雪松醇组、inhibitor-NC比较，miR-503-5p inhibitor组MCF7细胞中PCNA、MMP-2、TCF3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见图 5和表 4。
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注：A. control组；B. 雪松醇组；C. inhibitor-NC组；D. miR-503-5p inhibitor组。 图 5 Western blot检测MCF7细胞中PCNA、MMP-2、TCF3蛋白表达 Fig. 5 Expression of the PCNA, MMP-2 and TCF3 in MCF7 cells detected by Western blot |
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经starbase在线预测显示，miR-503-5p与TCF3基因有靶向结合位点，见图 6。与mimic-NC和TCF3-WT共转染组比较，miR-503-5p mimic和TCF3-WT共转染组的荧光素酶活性降低（P<0.05）；与mimic-NC和TCF3-MUT共转染组比较，miR-503-5p mimic和TCF3-MUT共转染组荧光素酶活性变化无统计学意义（P＞0.05），见表 5。
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| 图 6 miR-503-5p与TCF3的结合位点与突变位点 Fig. 6 Binding sites and mutation sites of miR-503-5p and TCF3 |
小鼠荷瘤实验结果表明，与对照组比较，雪松醇组小鼠移植瘤质量与体积明显下降（P<0.05）；qRT-PCR结果显示，雪松醇组移植瘤中miR-503-5p水平升高（P<0.05）；免疫组化检测结果显示，雪松醇组移植瘤中，TCF3、MMP-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05），见图 7、8和表 6。
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| 图 7 各组小鼠剥离的移植瘤 Fig. 7 Transplanted tumors of mice in each group |
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| 图 8 免疫组化检测移植瘤组织中TCF3、MMP-2蛋白表达（比例尺=100 μm） Fig. 8 Immunohistochemical detection of TCF3 and MMP-2 protein expression in transplanted tumor tissues (bar=100 μm) |
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BC因其高病死率和发病率而成为女性的主要健康问题，即使使用辅助化疗，转移性BC的30年生存率也低于1%[14]。因此，揭示BC发生的关键分子机制，对于提高BC患者的诊断和治疗水平具有重要意义。
雪松醇因具有良好的抗肿瘤活性而备受关注。雪松醇通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡抑制体内体外结直肠癌、肺癌的生长，被认为是治疗结直肠癌、肺癌的有效药物[5, 7]。Chang等[6]研究发现，雪松醇通过诱导细胞内活性氧（ROS）生成、触发DNA损伤和阻断雄激素受体的核易位，有效抑制胶质母细胞瘤细胞生长。此外研究发现，雪松醇通过阻断丝苏氨酸蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途径降低胶质母细胞瘤对替莫唑胺的耐药性，通过质膜脂质筏的失稳增强癌细胞化疗的敏感性[6, 15]。本研究发现，雪松醇降低MCF-7细胞OD490值、Edu阳性细胞率、迁移与侵袭数、PCNA、MMP-2蛋白表达水平和移植瘤质量。提示，雪松醇可抑制MCF7细胞增殖、迁移和侵袭，具有抗BC的作用。
越来越多的证据表明miRNAs可作为癌症的诊断标志物和治疗靶点[16]。miR-503-5p在多数肿瘤中呈低表达，发挥抗癌基因的作用，如在胃癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌中低表达，过表达miR-503-5p后可抑制肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭等恶性行为。本研究发现，miR-503-5p在BC组织和细胞中低表达，雪松醇可促进miR-503-5p在MCF7细胞和移植瘤中的表达，并且抑制miR-503-5p表达后，可逆转抑制雪松醇对MCF7细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。推测雪松醇可能通过上调miR-503-5p表达，从而抑制BC细胞增殖、迁移和侵袭。
miRNA通过与靶mRNA内的互补序列进行碱基配对，在基因表达的转录后调控中发挥作用。经生物信息学分析显示，miR-503-5p与TCF3之间存在结合位点，双荧光素酶报告基因实验证实了miR-503-5p与TCF3之间存在靶向关系。TCF3是Wnt通路相关T细胞特异性转录因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）转录因子家族的成员。研究表明，TCF3在包括BC在内的多种肿瘤中发挥促癌作用[13]。然而，致癌驱动因素TCF3如何影响BC进展的分子机制尚未完全阐明。本研究发现，TCF3蛋白在BC组织中和细胞中高表达，雪松醇可下调TCF3在MCF7细胞和移植瘤中的表达，而抑制miR-503-5p表达后，TCF3蛋白表达水平升高，减弱了雪松醇对TCF3蛋白表达的抑制作用，证实了雪松醇可能通过上调miR-503-5p表达来下调TCF3蛋白表达，进而抑制BC细胞增殖、迁移和侵袭。
综上所述，雪松醇能抑制BC细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与调控miR-503-5p/TCF3轴有关，miR-503-5p/TCF3轴可能成为治疗BC的新靶点，然而本研究尚存在不足之处，仅验证了雪松醇调控miR-503-5p/TCF3轴对BC细胞增殖、迁移和侵袭的作用，而未对其他靶点和通路进行验证，后续需要进一步开展研究。
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